大黄鱼雌激素受体与雄激素受体基因的克隆与表达分析

论文摘要

大黄鱼（Larimichthys crocea）是我国重要的海洋经济鱼类之一，主要分布在我国东南沿海地区。大黄鱼因其体色金黄、肉质鲜美及营养丰富等优点深受人们的喜爱。目前，对大黄鱼生殖繁育、形态特征和性腺发育的细胞水平等方面已有深入研究。但与其它脊椎动物相比，大黄鱼性腺发育等生殖方面的分子生物学研究仍处于起始阶段。因此，通过分子生物学方法克隆和分析大黄鱼性腺发育相关基因，将可为进一步阐明大黄鱼性腺发育和性别差异的分子机制提供理论依据。本研究在实验室构建的大黄鱼性腺EST数据库的基础上筛选获得雄激素受体（Nuclear Androgen Receptor, nAR）基因片段，同时根据NCBI数据库中已有的鱼类三种雌激素受体基因（Nuclear Estrogen Receptor, nER）分别设计简并引物，利用RT-PCR方法获得大黄鱼nER不同亚型的基因片段。在此基础上通过SMART RACE技术成功克隆得到大黄鱼三种nER亚型，nERα、nERβ1和nERβ2，及nAR的全长cDNA序列，并通过实时定量PCR技术分析这些基因在雌雄大黄鱼各组织器官以及大黄鱼胚胎发育不同时期的表达情况。结果如下：1)nERα的cDNA序列全长2989bp，包括508bp的5’非编码区域、494bp的3’非编码区（去除polyA部分）和1896bp的开放阅读框，该开放阅读框可编码631个氨基酸，预测分子量为69.23kDa。实时定量PCR显示，nERα基因在雌雄大黄鱼各组织器官中均有表达，其中在雌雄的肝脏和精巢中表达量最高。并且，nERα mRNA随着胚胎发育表达呈下降趋势，在多细胞期、囊胚期和原肠期表达量较高，随后显著下降。2)nERβ1的cDNA序列全长2538bp，包括572bp的5’非编码区域、228bp的3’非编码区（去除polyA部分）和1710pb的开发阅读框，该开放阅读框可编码569个氨基酸，预测分子量为63.24kDa。实时定量PCR显示，nERβ1基因在雌雄大黄鱼各组织器官均有表达，其中在精巢和卵巢中表达量最高。在胚胎发育早期阶段，nERβ1表达处于较高水平，囊胚期过后的表达水平显著下降。从原肠期开始nERβ1mRNA表达量均处于较低水平。3)nERβ2的cDNA序列全长2326bp，包括215bp的5’非编码区域、66bp的3’非编码区（去除polyA部分）和2025pb的开发阅读框，该开放阅读框可编码674个氨基酸，预测分子量为74.97kDa。实时定量PCR显示，nERβ2在雌雄大黄鱼各组织器官中均有表达，在雌性肝脏中表达量最高，其次是雄性肝脏，两者存在显著差异（P<0.05）。在大黄鱼胚胎发育过程中，nERβ2基因在胚胎发育各时期表达水平无显著性差异（P>0.05）。4)nAR的cDNA序列全长2840bp，包括240bp的5’非编码区、382bp的3’非编码区（去除polyA部分）和2250bp的开放阅读框，该开放阅读框可编码750个氨基酸，预测其蛋白分子量为84.50kDa。实时定量PCR显示， nAR在雌雄大黄鱼各组织器官中均有表达，在雌雄肝脏和性腺中表达量最高。nAR在胚胎发育的囊胚期表达水平最高，其次是多细胞期。除多细胞期和囊胚期以外的胚胎各发育时期nAR基因表达水平均较低。本研究采用原位杂交技术分析各基因在大黄鱼配子发生过程中的定位表达情况，结果如下：1)nERα mRNA在精子发生各时期的生殖细胞中均有表达。在精原细胞，杂交信号只在细胞核中被检测到，并且其杂交信号最为强烈。而在初级精母细胞、次级精母细胞和精子细胞中，杂交信号主要集中在细胞质。nERα mRNA在卵子发生的第Ⅰ时相卵母细胞中主要定位在细胞质。在第Ⅱ时相及第Ⅲ时相卵母细胞周围的滤泡细胞中均存在强烈的杂交信号，此外，卵母细胞细胞质中也有杂交信号。在第Ⅳ时相卵母细胞及退化卵母细胞中，nERα mRNA杂交信号主要集中在卵母细胞周围的滤泡细胞中。2)在精子发生过程中nERβ1在精原细胞的细胞核中杂交信号最强，而在初级精母细胞细胞质中杂交信号相对较弱。此外，在次级精母细胞细胞质、整个精子细胞以及精子中均存在杂交信号。nERβ1mRNA在卵子发生过程中的第Ⅰ时相卵母细胞中主要定位在细胞核，在细胞质中具有较弱的杂交信号。在第Ⅱ、Ⅲ时相卵母细胞周围的滤泡细胞中存在最强的杂交信号，同时发现，第Ⅱ、Ⅲ时相卵母细胞的细胞质中具有较强的杂交信号。在第Ⅳ时相卵母细胞及退化卵母细胞的细胞质中，几乎无杂交信号。而在卵母细胞周围的滤泡细胞中则存在nERβ1mRNA杂交信号。3)nERβ2在精子发生过程中主要在次级精母细胞、精子细胞和精子中表达,而在精原细胞中几乎无杂交信号。在初级精母细胞中杂交信号相对较弱，并且主要分布在细胞外周。nERβ2mRNA在卵子发生过程中的第Ⅰ、Ⅱ时相卵母细胞主要定位在细胞质中，细胞核中无杂交信号。在第Ⅲ、Ⅳ时相卵母细胞及退化卵母细胞中均无杂交信号。4)nAR在精子发生过程中的分布较广泛，在精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子中均有表达，且在精原细胞细胞核以及初级精母细胞中杂交信号较强，其他细胞中杂交信号则较弱。nAR mRNA在卵子发生过程中的第Ⅰ、第Ⅱ和第Ⅲ时相卵母细胞中主要定位在细胞质，在第Ⅳ时相卵母细胞及退化期卵母细胞中主要定位在其周围的滤泡细胞中，在卵母细胞细胞质中也存在杂交信号。综上所述，克隆与分析nER与nAR基因在大黄鱼各组织器官和胚胎发育各时期表达情况以及配子发生过程的定位情况结果说明nERα、nERβ1、nERβ2和nAR在性腺发育，配子发生和胚胎发育早期等方面发挥重要作用。本工作为阐明大黄鱼生殖的分子机制奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 本研究的目的与意义
• 1.2 雌激素受体基因的研究进展
• 1.3 雄激素受体基因的研究进展
• 1.4 主要研究内容和技术路线
• 第2章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 总 RNA 的提取（RDP 法）和去除 DNA 的污染
• 2.2.2 合成 RT-PCR cDNA 第一链和 PCR 扩增获取基因 cDNA 片段
• 2.2.3 SMART-RACE 技术获取基因全长
• 2.2.4 割胶纯化基因片段
• 2.2.5 与质粒载体连接
• 2.2.6 感受态细胞的转化及筛选
• 2.2.7 质粒插入片段的检测
• 2.2.8 质粒测序
• 2.2.9 目的基因的生物信息学分析
• 2.2.10 实时荧光定量 PCR 反应体系及条件
• 2.2.11 石蜡切片
• 2.2.12 HE 染色
• 2.2.13 原位杂交
• 第3章 结果
• 3.1 总 RNA 的抽提结果
• 3.2 RT-PCR 扩增结果
• 3.3 RACE-PCR 扩增结果
• 3.4 基因序列分析
• 3.4.1 nERα基因序列分析
• 3.4.2 nERβ1 基因序列分析
• 3.4.3 nERβ2 基因序列分析
• 3.4.4 nAR 基因序列分析
• 3.5 各基因在不同组织器官中表达结果
• 3.5.1 nERα在雌雄各组织器官中表达分析
• 3.5.2 nERβ1 在雌雄各组织器官中表达分析
• 3.5.3 nERβ2 在雌雄各组织器官中表达分析
• 3.5.4 三种 nER 亚型在雌雄性腺及肝脏中差异表达
• 3.5.5 nAR 在雌雄各组织器官中表达分析
• 3.6 各基因在胚胎发育不同时期的表达分析
• 3.6.1 nERα在胚胎发育不同时期的表达分析
• 3.6.2 nERβ1 在胚胎发育不同时期的表达分析
• 3.6.3 nERβ2 在胚胎发育不同时期表达分析
• 3.6.4 nAR 在胚胎发育不同时期的表达分析
• 3.7 各基因在配子发生过程中的定位表达研究
• 3.7.1 nERα基因在精子发生过程中的定位表达
• 3.7.2 nERα基因在卵子发生过程中的定位表达
• 3.7.3 nERβ1 基因在精子发生过程中的定位表达
• 3.7.4 nERβ1 基因在卵子发生过程中的定位表达
• 3.7.5 nERβ2 基因在精子发生过程中的定位表达
• 3.7.6 nERβ2 基因在卵子发生过程中的定位表
• 3.7.7 nAR 基因在精子发生过程中的定位表达
• 3.7.8 nAR 基因在卵子发生过程中的定位表达
• 第4章 讨论
• 4.1 nER 基因
• 4.2 nAR 基因
• 第5章 结论与展望
• 致谢
• 参考文献
• 在学期间发表的学术论文