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黄瓜热激因子结合蛋白1（CsHSBP1）基因的克隆与功能分析

2020-11-21阅读(326)

黄瓜热激因子结合蛋白1（CsHSBP1）基因的克隆与功能分析

论文摘要

黄瓜（cucumis sativus L.）又名胡瓜、王瓜,原产于印度北部,喜马拉雅山脉的库曼、锡金一带,是葫芦科（Cucurbitaceae）甜瓜属的一个栽培种。黄瓜性喜温暖、不耐寒冷,生长发育最适温度为25-30℃,高温胁迫的温度界限为30℃,超过35℃植株生长停滞,50℃作用1h则呼吸停止,60℃仅5-6min就会导致植株枯死。黄瓜具有营养丰富、品种多、产量高、供应期长等特点,不仅露地的栽培面积大,而且1990年以来保护地的生产也迅速发展,是我国南北方在栽培面积上仅次于番茄的重要果菜之一。但是,露地和保护地栽培中的高温胁迫极易给黄瓜生产造成较大损失,这种损失在长江流域及其以南地区尤为严重。培育耐高温的优良品种是解决这一问题的根本途径,然而,黄瓜种内缺乏耐热的品种和资源材料。弄清黄瓜耐热、不耐热或热激反应的分子机制,对于生理调节或分子改良黄瓜耐热性具有重要价值。 热激因子结合蛋白（HSBP）是一类高度保守的、结构特殊的蛋白家族,它参与生物体热激蛋白基因表达的调控过程,对热激蛋白基因的表达起负调控作用。本研究克隆了黄瓜热激因子结合蛋白1（CsHSBP1）基因,Southern杂交分析了基因拷贝数,RT-PCR分析了表达情况,并对该基因及其推导的氨基酸序列和结构进行了分析,为今后深入研究该基因在黄瓜热激反应中的作用奠定了基础。 1 CsHSBP1基因的克隆 将-80℃保存的黄瓜幼果cDNA原始文库感染宿主细胞XL1-Blue后倒平板,37℃培养获得噬菌斑。挑取单个噬菌斑于裂解液中裂解出λ噬菌体,感染宿主细胞BM25.8后31℃培养进行亚克隆。随机选取分离良好的白色菌斑进行菌落PCR筛选,初步确定为阳性克隆后提取质粒,检测质粒大小并通过质粒PCR确定插入片段大小。委托上海鼎安生物技术公司从cDNA的5’端进行测序。通过EST序列分析,发现了与热激反应相关的HSBP1基因,命名为CsHSBP1。 根据获得的CsHSBP1基因序列设计PCR引物,采用pfu高保真DNA聚合酶进行巢式PCR扩增,电泳回收340bp的编码区cDNA片段,Taq DNA聚合酶加“A”尾,采用TA克

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 文献综述
  • 1.1 黄瓜生物学研究进展
  • 1.1.1 黄瓜的起源与分布
  • 1.1.2 黄瓜的生物学特性
  • 1.1.3 高温胁迫对黄瓜体内蛋白的影响
  • 1.2 热激蛋白相关因子研究进展
  • 1.2.1 Hsp70
  • 1.2.2 热激元件（HSE）
  • 1.2.3 热激因子（HSF）
  • 1.2.4 热激因子结合蛋白（HSBP）
  • 1.3 相关PCR技术
  • 1.3.1 巢式PCR
  • 1.3.2 Cassette PCR
  • 1.3.3 RT-PCR
  • 第二章 引言
  • 第三章 材料与方法
  • 3.1 材料
  • 3.1.1 cDNA文库材料
  • 3.1.2 植物材料
  • 3.1.3 载体与菌株
  • 3.1.4 分子生物学试剂
  • 3.1.5 pMD18-T质粒载体图谱
  • 3.1.6 部分试剂配置
  • 3.2 主要仪器
  • 3.3 实验方法
  • 3.3.1 cDNA文库质量检测、插入片段分析、原始文库的扩增与保存
  • 3.3.2 CsHSBP1基因克隆
  • 3.3.3 CsHSBP1基因编码区片段巢式PCR扩增
  • 3.3.4 PCR产物纯化
  • 3.3.5 平端加"A"
  • 3.3.6 目标片段回收
  • 3.3.7 连接
  • 2法）'>3.3.8 大肠杆菌DH5a菌株感受态的制备（冷CaCl2法）
  • 3.3.9 转化
  • 3.3.10 Clony PCR检测
  • 3.3.11 质粒提取、质粒PCR检测
  • 3.3.12 探针制备
  • 3.3.13 Southern杂交
  • 3.3.14 CsHSBP1基因表达特性分析
  • 第四章 结果与分析
  • 4.1 CsHSBP1基因全长cDNA克隆及其编码区亚克隆
  • 4.1.1 CsHSBP1基因克隆PCR检测
  • 4.1.2 CsHSBP1基因编码区片段PCR扩增
  • 4.1.3 CsHSBP1基因编码区Clony PCR检测
  • 4.1.4 质粒提取及质粒PCR鉴定
  • 4.2 CsHSBP1基因及其推导氨基酸序列的同源性分析
  • 4.3 CsHSBP1基因及其编码蛋白的结构分析
  • 4.3.1 CsHSBP1基因结构及酶切位点分析
  • 4.3.2 CsHSBP1蛋白二级结构预测
  • 4.3.3 CsHSBP1蛋白理化性质预测
  • 4.3.4 CsHSBP1蛋白高级结构预测
  • 4.4 Southern杂交
  • 4.4.1 探针浓度检测
  • 4.4.2 基因组DNA提取
  • 4.4.3 酶切效果检测
  • 4.4.4 Southern杂交检测
  • 4.5 RT-PCR分析
  • 4.5.1 黄瓜总RNA提取
  • 4.5.2 RT-PCR表达特性分析
  • 第五章 讨论
  • 第六章 结论
  • 6.1 CsHSBP1基因克隆
  • 6.2 CsHSBP1基因及其推导氨基酸序列的同源性分析
  • 6.3 CsHSBP1基因及其编码蛋白质的结构分析
  • 6.4 CsHSBP1基因基因组拷贝数分析
  • 6.5 CsHSBP1基因表达特性分析
  • 参考文献
  • 缩写词
  • 致谢
  • 发表论文

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