论文摘要
目的:本项研究利用基因芯片技术,对大鼠肝纤维化肝细胞的基因谱进行分析,寻找肝纤维化进程中肝细胞的差异基因,从基因水平探讨肝纤维化的发病机制;同时观察源于生物发酵提取物的川芎嗪对肝纤维化肝细胞癌基因的干预作用。药物:川芎嗪生物发酵提取物晶体由上海爱普香料有限公司提供。将川芎嗪晶体3.5g溶于70ml的CCl4与精制橄榄油（1:6）混合液中（每ml含晶体0.05g）,60℃水浴并摇晃至溶解。4℃保存备用。基因芯片:大鼠12K全基因芯片购自上海生物芯片有限公司。方法:1.动物处理:健康SD雄性大鼠120只,体重180—220g,随机分3组。模型组:参照并改进Hernandez-Munoz法建立肝纤维化动物模型,腹腔注射0.2ml CCl4 （精制橄榄油1:6稀释）,每周3次,共8周。正常组:以精制橄榄油按受试药物组同等剂量和次数腹腔注射。药物组:腹腔注射0.2ml川芎嗪CCl4与精制橄榄油（1:6）混合液,（每ml含川芎嗪晶体0.05g）,每周3次,共8周。各组每隔2周分别处死2只动物用于肝细胞分离,6只动物用于血清制备,2只动物用于肝组织切片。2.常规肝组织切片制备,部分用于常规H-E染色,部分用于免疫组织化学反应3.血清的制备与检测常规制备血清,自动生化分析仪检测大鼠各组血清的丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶和谷氨酰转肽酶。4.基因芯片制备5.指标检测:采用血清学肝功指标检测各组大鼠肝功能;采用免疫组织化学方法检测模型组和药物组大鼠肝组织p53和c-met的表达;采用基因芯片研究p53和c-met相关基因的表达;采用基因芯片研究CCl4所致肝纤维化大鼠肝细胞基因谱的表达。6.统计学处理:采用SPSS软件对相关实验数据进行统计学处理,行单因素方差分析。开展的相关实验:1.大鼠肝细胞基因芯片的制备2.源于生物发酵提取物的川芎嗪对肝纤维化模型动物的干预作用3.源于生物发酵提取物的川芎嗪对肝纤维化肝细胞相关癌基因表达的干预作用4. CCl4所致肝纤维化大鼠肝细胞基因谱研究实验结果:1.源于生物发酵提取物的川芎嗪可明显减轻肝纤维化程度。2.源于生物发酵提取物的川芎嗪可改善肝脏功能,其药物作用发挥于6-8周。3.正常组和药物组免疫组织化学反应均无p53和c-met阳性反应物检出,8周模型组p53免疫组织化学反应检出阳性反应物,主要分布于中央静脉周围。c-met免疫组织阳性反应物在6周和8周均有检出。4.源于生物发酵提取物的川芎嗪可下调BG671424号编码p53结合蛋白（LOC304798）的mRNA水平。5.源于生物发酵提取物的川芎嗪对HGF激活物基因在肝纤维化肝癌的早期具有上调作用,中晚期具有下调作用。6.造模2周时,筛选出差异表达基因共184条,其中上调基因110条,下调基因74条;造模4周时,筛选出差异表达基因共273条,其中上调基因129条,下调基因144条;造模6周时,筛选出差异表达基因361条,其中上调基因134条,下调基因227条;造模8周时,筛选出差异表达基因1872条,其中上调基因763条,下调基因1109条。结论:1.源于生物发酵提取物的川芎嗪可明显减轻肝脏损伤,保护肝脏功能,延缓肝纤维化进程,其药物作用发挥于6-8周。2.源于生物发酵提取物的川芎嗪对肝纤维化后期的癌变有明显抑制作用,可通过下调BG671424号编码p53结合蛋白（LOC304798）的mRNA水平,进而下调该结合蛋白的水平,促进野生型p53的凋亡作用,抑制突变型p53基因的致癌作用。3.源于生物发酵提取物的川芎嗪对肝纤维化后期的癌变有明显抑制作用,可抑制c-met表达。但对相关基因的抑制作用尚缺乏基因芯片的直接证据。4. MAPK通路参与CCl4所致肝纤维化的发病机制。CCl4对细胞色素P450酶系中的CYP3A家族基因有上调作用。