奶牛白色念珠菌性乳腺炎的快速诊断及中药治疗研究

论文摘要

为了寻找一种能够快速诊断奶牛白色念珠菌性乳腺炎的方法和有效治疗该病的中药方剂,本研究进行了共四个部分的试验,第一部分根据白色念珠菌ITS1-ITS2部分的保守序列设计了一对特异性引物,建立了奶牛白色念珠菌性乳腺炎的PCR检测方法;第二部分通过中药药敏试验,本着中医辩证施治的原理,自拟了治疗奶牛白色念珠菌性乳腺炎的纯中药方剂“乳炎消”;第三部分则对筛选出的中药方剂的急性毒性和细胞毒性进行了检测;第四部分以奶山羊为实验动物模型进行了中药治疗白色念珠菌性乳腺炎的研究,并进行了“乳炎消”方剂的临床治疗试验。第一部分用PCR方法诊断奶牛白色念珠菌性乳腺炎的研究查阅了GenBank已发表的ITS1-ITS2序列,根据白色念珠菌ITS1-ITS2部分的保守序列设计了一对特异性引物,对患牛乳样中分离到的4珠白色念珠菌进行了PCR扩增,结果表明,扩增产物均为500bp,检测工作仅耗时2.5h;同时,对照试验表明,该对引物不能扩增大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌等常见的乳房炎致病细菌。敏感性实验结果表明,该方法的敏感性可达到1.25×103 CFU/mL。对50份患牛乳样进行了细菌学培养和生化实验检测及PCR检测,结果传统方法检测到白色念珠菌的阳性率为16%,而PCR方法检测到白色念珠菌的阳性率为18%。传统方法检测为阳性的样品,PCR检测全部为阳性。因此,用PCR方法检测奶牛白色念珠菌性乳腺炎是一种快速、敏感和特异的方法,对兽医临床中白色念珠菌性乳腺炎的诊断具有一定的参考价值。第二部分治疗奶牛酵母菌性乳腺炎中药方剂的筛选本着中医辨症施治的原理,以调气活血、消肿散淤、提高机体免疫力为原则,自拟了三组中药方剂,进行了单味中药及三组自拟中药方剂的体外平板抑菌试验,各单味中药结果表明:黄连和黄芩对4种酵母菌的抑制作用均较强;而蒲公英、连翘、鱼腥草对酵母菌没有抑制作用;苦参、升麻、姜黄、仙鹤草对不同的酵母菌有一定的抑制作用。三组方剂结果表明:方剂1的抑菌效果明显好于其它两组方剂。在方剂1的基础上调整筛选组方,最后筛选出一种纯中药方剂,定名为“乳炎消”,并进行了MIC（最低抑菌浓度）试验。结果表明,该方剂对白色念珠菌等奶牛酵母菌性乳腺炎的主要致病菌具有较好的抑菌效果,MIC值较低,平均为0.116g/mL。第三部分中药“乳炎消”方剂毒性检测为了确保临床用药安全,通过不同的试验途径和方法测定方剂“乳炎消”对小鼠的急性毒性和对L929（小鼠成纤维母细胞）细胞的毒性。体内急性毒性试验进行了半数致死量（LD50）和最大耐受量（MTD）为的检测,用40g/kg体重剂量的乳炎消方剂给小鼠灌胃,1周后小鼠未发生死亡,再在小鼠可接受的最大容积下,给小鼠灌服日累积剂量为120g/kg体重的乳炎消方剂进行MTD试验,1周后处死观察其病理变化。体外细胞毒性试验采用形态学观察和MTT两种方法,测试乳炎消方剂在L929体外培养中的最大无毒浓度（TC0）。结果表明:（1）乳炎消方剂毒性很低,其LD50超过40g/kg体重,MTD超过120g/kg体重。根据毒性分级标准,可认为中药方剂在短期内使用是安全的。（2）体外培养结果显示,乳炎消方剂对L929细胞的最大无毒浓度达1.56g/L。第四部分“乳炎消”方剂的治疗效果研究本试验以30头健康泌乳奶山羊为试验动物,将其分为三组:正常对照组、发病用药组和发病末用药组,每组10只。用白色念珠菌菌液1mL从乳头管注入发病用药组和发病末用药组奶山羊的乳室,成功地诱发奶山羊急性乳炎腺的发生, 48h后出现红、肿、热、痛等炎症反应,并伴有精神萎靡,食欲下降等症状。并从患羊乳汁中分离到白色念珠菌。用乳炎消方剂给发病用药组灌服（2mL/kg体重）,每天一次,连用5天后发病用药组羊只有8只康复,2只症状明显减轻。而发病未用药的羊只症状加重或无明显改善,用药前后分别采集三组奶山羊的血样和乳样进行了血液流变学分析、淋巴细胞转化试验和乳成份分析,血液流变学指标的测定表明,治疗前发病羊只的全血粘度、全血还原粘度、血浆粘度、红细胞聚集指数和刚性系数均显著高于正常对照组（P<0.05）,治疗后发病用药组上述指标基本恢复正常,而发病末用药组的各项指标仍显著高于正常对照组（P<0.05）。淋巴细胞转化试验表明,治疗前发病羊只的淋巴细胞转化率显著低于正常对照组（P<0.05）,治疗后发病用药组这一指标基本恢复正常,而发病未用药组仍显著高于正常对照组。乳成分对比分析发现,治疗前发病羊只的乳糖、乳脂肪显著低于正常对照组（P<0.05）,而乳蛋白、体细胞数显著升高（P<0.05）,治疗后发病用药组上述指标基本恢复正常,而发病末用药组无明显变化。证明该中药方剂能够有效治疗白色念珠菌性乳腺炎。临床治疗试验表明,该中药方剂可使患牛临床症状消失,产奶量回升。证明该中药方剂对奶牛白色念珠菌性乳腺炎疗效显著,不易复发。

论文目录

• 中英文缩略表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 试验一 用PCR 方法诊断奶牛白色念珠菌性乳腺炎的研究
• 材料与方法
• 结果与分析
• 讨论
• 试验二 治疗奶牛酵母菌性乳腺炎的中药方剂的筛选
• 材料与方法
• 结果与分析
• 讨论
• 试验三 中药“乳炎消”方剂的毒性检测
• 乳炎消方剂的急性毒性研究
• 材料与方法
• 结果与分析
• 乳炎消方剂的体外细胞毒性测定
• 材料与方法
• 结果与分析
• 讨论
• 试验四 “乳炎消”方剂的治疗效果研究
• 材料与方法
• 结果与分析
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 作者简介