样品前处理结合液质联用技术在生物样品分析中的应用

论文摘要

生物样品的组成复杂、基体干扰大,同时样品一般较难获得而且量少,被分析物的浓度通常又很低,因此对生物样品分离分析技术提出的要求越来越高。为了建立高灵敏度、高选择性的生物样品分析方法,可以从样品的前处理和检测技术两方面着手,其中样品的前处理最具可行性,同时也最具挑战性。聚合物整体柱微萃取（PMME）是以聚合物整体材料为萃取介质的新型固相微萃取的样品前处理技术,具有制备方法简单、内部结构均匀、使用寿命长、重现性好以及萃取效率高等优点。通过制备不同的萃取材料,聚合物整体柱被广泛用于药物及代谢产物、生物大分子、蛋白质和其他生物活性物质的萃取分离中。作者所在课题组在聚合物整体材料的研究和应用方面做了大量的工作,制备了以聚（甲基丙烯酸-乙二醇二甲基内烯酸酯）为代表的多种聚合物整体柱,并且已经应用于一些生物样品的检测中,取得了较好的效果。与此同时,在生物样品分析中,可将其他样品前处理技术如化学衍生与萃取相结合,以及结合PMME与色谱在线联用的方法,进一步提高生物样品的纯化和富集效果,使检测的灵敏度更高、重现性更好。本论文主要围绕聚合物整体柱微萃取、液-液萃取、柱前衍生等样品前处理方法,结合高效液相色谱、液相色谱与质谱联用技术,在一些生物样品分析中的应用开展了一些工作,主要内容如下：1.介绍了目前生物样品前处理的一些主要的方法和新的发展方向,简单介绍了脑细胞色素P450的研究情况。2.建立了以氯唑沙宗为底物,液-液萃取结合液质联用的方法,检测大鼠不同脑区微粒体中CYP2E1酶活性的方法。所建立的方法简单,较报道的高效液相色谱紫外检测方法灵敏度高100倍左右,所需样本量小,可以做到大鼠各脑区的个体化检测。3.建立了以右美沙芬为底物,以聚（甲基丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯）（Poly （MAA-co-EGDMA））整体柱微萃取与液质联用在线联用及液-液萃取结合液质联用,检测大鼠不同脑区微粒体中CYP2D6活性的两种分析方法。4.建立了以2,4-二硝基苯肼为衍生试剂,聚（甲基丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯）（Poly （MAA-co-EGDMA））整体柱微萃取与高效液相色谱联用,检测咖啡、蜂蜜、啤酒、可乐及尿液中5-羟甲基呋喃糠醛的分析方法。结果表明,该方法灵敏度高,且具有较好的精密度和准确度,适合于食品、药品及生物样品等复杂样品中微量的5-羟甲基呋喃糠醛检测。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 生物样品前处理
• 1.1.1 液-液萃取
• 1.1.2 液相微萃取
• 1.1.2.1 单滴液相微萃取
• 1.1.2.2 中空纤维液相微萃取
• 1.1.2.3 分散液液微萃取
• 1.1.3 固相萃取
• 1.1.4 固相微萃取
• 1.1.4.1 纤维针式固相微萃取
• 1.1.4.2 管内固相微萃取
• 1.1.4.3 SPME用于活体原位采样
• 1.1.5 化学衍生
• 1.2 脑细胞色素P450
• 1.3 论文选题依据、意义和研究内容
• 参考文献
• 第二章 基于氯唑沙宗探针的大鼠不同脑区细胞色素P450 2E1酶活性LC-MS检测方法
• 2.1 前言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 试剂与材料
• 2.2.2 实验动物
• 2.2.3 脑线粒体和微粒体膜的制备
• 2.2.4 CYP2E1催化的CLZ 6-羟化反应
• 2.2.5 样品前处理
• 2.2.6 标准曲线及质控样品的制备
• 2.2.7 仪器设备及分析条件
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 LC-MS条件的优化
• 2.3.2 萃取溶剂的选择
• 2.3.3 方法学考察
• 2.3.3.1 线性方程和检测限
• 2.3.3.2 精密度和准确度
• 2.3.3.3 基质效应和回收率
• 2.4 大鼠不同脑区中CYP2E1活性的检测
• 2.5 结论
• 参考文献
• 第三章 基于右美沙芬探针的大鼠不同脑区细胞色素P450 2D6酶活性LC-MS检测方法
• 3.1 前言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 试剂与材料
• 3.2.2 实验动物
• 3.2.3 脑线粒体和微粒体膜的制备
• 3.2.4 CYP2D6介导的右美沙芬酶促反应
• 3.2.5 聚合物整体柱微萃取与LC-MS在线联用检测DOR
• 3.2.5.1 Poly（MAA-co-EGDMA）整体柱的制备
• 3.2.5.2 仪器和操作条件
• 3.2.5.3 样品的制备
• 3.2.6 液-液萃取结合LC-MS/MS检测DOR
• 3.2.6.1 仪器和操作条件
• 3.2.6.2 样品前处理
• 3.2.6.3 标准曲线及质控样品的制备
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 LC-MS条件的优化
• 3.3.2 萃取条件优化
• 3.3.2.1 PMME与LC-MS在线联用萃取条件优化
• 3.3.2.1.1 在线萃取条件优化
• 3.3.2.1.2 在线清洗、解吸条件优化
• 3.3.2.1.3 萃取时间考察
• 3.3.2.2 液-液萃取,LC-MS/MS检测DOR萃取条件优化
• 3.3.3 方法学考察
• 3.3.3.1 PMME与LC-MS在线联用方法学考察
• 3.3.3.1.1 工作曲线和检出限
• 3.3.3.1.2 方法的精密度和准确度
• 3.3.3.2 液-液萃取,LC-MS/MS法检测DOR方法学考察
• 3.3.3.2.1 工作曲线和检出限
• 3.3.3.2.2 方法的精密度和准确度
• 3.4 实际样品的检测
• 3.5 结论
• 参考文献
• 第四章 柱前衍生-聚合物整体柱微萃取与液相色谱联用检测食品及尿液中的5-羟甲基呋喃糠醛
• 4.1 前言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 试剂与材料
• 4.2.2 样品处理
• 4.2.3 衍生过程
• 4.2.4 Poly（MAA-co-EGDMA）整体柱的制备
• 4.2.5 仪器设备及分析条件
• 4.2.6 PMME设备和操作步骤
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 衍生条件的优化
• 4.3.1.1 缓冲溶液的对衍生的影响
• 4.3.1.2 衍生试剂用量的考察
• 4.3.1.3 衍生化反应温度和时间的考察
• 4.3.1.4 衍生物几何异构体的鉴别
• 4.3.2 PMME条件的优化
• 4.3.2.1 缓冲溶液
• 4.3.2.2 萃取容量考察
• 4.3.2.3 吸附和解吸流速对萃取效率的影响
• 4.3.2.4 衍生试剂的用量对萃取的影响
• 4.3.2.5 PMME与直接进样比较
• 4.3.2.6 方法学考察
• 4.3.2.6.1 线性方程和检测限
• 4.3.2.6.2 精密度和准确度
• 4.4 样品分析
• 4.5 结论
• 参考文献
• 第五章 总结与展望
• 附录：作者在攻读博士学位期间已发表的论文
• 致谢