大球盖菇细胞工程育种及半野生栽培研究

论文摘要

大球盖菇是一种味道鲜美、营养丰富的珍稀食用菌。它能够利用秸秆、树叶等农林废弃物进行生长。本文初步探索了大球盖菇原生质体的制备和再生优化系统,得出:1.5%纤维素酶+1.5%蜗牛酶的混合酶（体积比为1∶1）来酶解菌丝,0.6mol/L的甘露醇作为渗透压稳定剂,最佳菌龄为3d,最适酶解温度为30℃,最适合的酶解时间为2.5h,在此条件下制得的原生质体产量最高可达1.70×107个/mL。确定了再生培养基的最佳渗稳剂是甘露醇,再生率可达0.89%。同时还确定了35s为最佳诱变大球盖菇原生质体的时间,致死率是73.33%,在这个剂量下更容易筛选得到正向突变的优良再生菌株。利用原生质体与紫外诱变相结合的技术,通过在各种培养料中长速、长势及液体发酵中还原糖利用率、生物量、菌球质量、各种胞外酶活性等指标的测定,选育出了一株栽培及发酵性能均优的菌株Dq084,其常规栽培生物转化率可达64.43%,明显高于出发菌株。经液体发酵实验得出其生物量、利用还原糖的能力和各种胞外酶活性均高于出发菌株,能更好的分解纤维素和木质素等,并确定这几种酶活性的高低与菌丝长速之间呈一定的正相关且通过增稠剂实验得出添加0.2%的黄原胶能增加液体培养中菌球密度和菌球数量。还通过酯酶同工酶测定,得出Dq084的电泳图谱与出发菌株有显著的区别,证明Dq084发生了遗传变异,是一株各方面均较优良的再生变异菌株。采用Dq084-液体培养-麦粒基质的菌种制备新工艺研究了半野生栽培的两种栽培模式畦栽法和袋栽法,得出采用玉米秸秆基质袋栽法较适合于北方冬春季节栽培,发菌较快,周期较短,生物转化率较高,达到了70.41%（对照为60.96%）;采用小麦秸秆畦栽法较适合于夏秋季节栽培,生物转化率是68.64%（对照为57.33%）。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 立题依据
• 1.1.1 课题来源
• 1.1.2 研究目的及意义
• 1.2 引言
• 1.3 大球盖菇简介
• 1.3.1 大球盖菇的分类地位及形态特征
• 1.3.2 大球盖菇的营养价值及药理作用
• 1.3.3 大球盖菇的生活习性
• 1.4 原生质体技术
• 1.4.1 原生质体简介
• 1.4.2 原生质体育种技术
• 1.5 同工酶技术在食用菌研究中的应用
• 1.6 我国秸秆利用现状
• 1.7 食用菌半野生栽培研究现状
• 第2章 大球盖菇原生质体制备再生条件及紫外诱变研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 供试菌株
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 大球盖菇菌丝体制备
• 2.3.2 酶液配置
• 2.3.3 大球盖菇原生质体制备与纯化
• 2.3.4 大球盖菇原生质体的再生
• 2.3.5 酶种类及浓度的影响实验
• 2.3.6 菌龄的影响实验
• 2.3.7 酶解温度的影响实验
• 2.3.8 渗稳剂种类的影响实验
• 2.3.9 酶解时间的影响实验
• 2.3.10 渗稳剂对大球盖菇原生质体再生的影响
• 2.3.11 紫外线诱变大球盖菇原生质体
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 大球盖菇原生质体的释放方式
• 2.4.2 酶种类及浓度对大球盖菇原生质体产量的影响
• 2.4.3 菌龄对大球盖菇原生质体产量的影响
• 2.4.4 酶解温度对大球盖菇原生质体产量的影响
• 2.4.5 渗稳剂种类对大球盖菇原生质体产量的影响
• 2.4.6 酶解时间对大球盖菇原生质体产量的影响
• 2.4.7 正交实验设计及结果
• 2.4.8 渗稳剂对大球盖菇原生质体再生的影响
• 2.4.9 紫外线对大球盖菇原生质体的诱变效应
• 2.5 小结
• 第3章 大球盖菇再生变异株栽培优良菌株筛选
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 供式菌株
• 3.2.2 培养基
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 大球盖菇再生菌株的初筛
• 3.3.2 再生菌株的复筛
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 大球盖菇再生菌株的初筛
• 3.4.2 大球盖菇再生菌株的复筛
• 3.5 小结
• 第4章 大球盖菇优良变异菌株的液体发酵性能研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 供试菌株
• 4.2.2 培养基
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 液体菌种的制备
• 4.3.2 二级液体培养基增稠剂及其添加量的选择
• 4.3.3 二级液体发酵过程中各参数的测定
• 4.3.4 发酵过程中相关酶学研究
• 4.3.5 大球盖菇液体菌种应用研究
• 4.4 结果和分析
• 4.4.1 二级液体培养基增稠剂及剂量的选择实验
• 4.4.2 二级液体发酵过程中各菌株的各个参数的测定
• 4.4.3 发酵过程中相关酶学研究
• 4.4.4 液体菌种出菇实验
• 4.5 小结
• 第5章 大球盖菇再生变异菌株的酯酶同工酶电泳
• 5.1 引言
• 5.2 实验材料
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 溶液配制
• 5.3.2 菌丝体制备
• 5.3.3 酶提取液制备
• 5.3.4 制胶和电泳
• 5.3.5 染色
• 5.3.6 酶谱分析
• 5.4 结果与分析
• 5.4.1 酯酶同工酶谱分析
• 5.4.2 酯酶同工酶谱相似系数分析
• 5.5 小结
• 第6章 大球盖菇半野生栽培研究
• 6.1 引言
• 6.2 实验材料
• 6.2.1 供试菌株
• 6.2.2 培养基
• 6.3 实验方法
• 6.3.1 液体菌种的制备
• 6.3.2 麦粒种的制备
• 6.3.3 栽培种的制备
• 6.3.4 适宜种植林地的选择
• 6.3.5 大球盖菇半野生栽培方法
• 6.4 结果与分析
• 6.4.1 畦栽法出菇结果
• 6.4.2 袋栽法出菇结果
• 6.5 小结
• 第7章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间取得的科研成果