鸡堆型艾美耳球虫特异性单链抗体基因的构建及其表达

论文摘要

本试验将堆型艾美耳球虫通过卵囊的纯化、研磨、胰酶脱囊、DEAE-52层析柱纯化、反复冻融、超声裂解制备出子孢子抗原,利用此抗原检测杂交瘤细胞上清液,获得阳性杂交瘤细胞。利用酸性酚-硫氰酸胍-氯仿法提取杂交瘤细胞总RNA,琼脂糖凝胶电泳证明鸡堆型艾美耳球虫特异性杂交瘤细胞基因组RNA提取成功。以提取的RNA为模板,利用引物Oligo（dT）18合成cDNA。根据Genebank上的相关序列,合成两对引物,并以cDNA为模板,扩增出轻链可变区和重链可变区。经琼脂糖检测,发现轻链可变区基因的大小约312bp,重链可变区基因在381bp左右。从琼脂糖凝胶上切下所需DNA片段,用玻璃奶回收试剂盒回收轻链、重链可变区,经琼脂糖凝胶电泳检测回收产物,将回收效果好的产物与克隆载体pMD18-T连接,转化于用氯化钙制备的感受态细胞JM109,蓝白斑法筛选出阳性重组子。以RV-M/M13-47为引物对阳性重组子进行鉴定,菌落-PCR检测证明八个阳性重组子均为阳性。提取阳性质粒DNA并测序。测序结果显示轻链可变区和重链可变区基因符合鸡抗体轻链可变区和重链可变区基因特征,但发现与抗原表位互补结合的互补决定区（CDR）基因有多数发生改变,且在轻链可变区基因的CDR3中有基因缺失现象。回收的轻链可变区和重链可变区基因产物等摩尔浓度混合后,用重叠延伸拼接法扩增出单链抗体基因,再用带限制性内切酶位点的引物（Nco Ⅰ和HindⅡ）扩增出带有特定酶切位点的单链抗体基因片段。Nco Ⅰ和HindⅢ双酶切单链抗体与表达载体pET-22b（+）,回收试剂盒回收酶切后的单链抗体与表达载体pET-22b（+）基因片段,连接试剂盒将单链抗体与表达载体pET-22b（+）基因片段连接,并将连接产物转化感受态细胞JM109。氨苄青霉素筛选阳性重组子,以T7promoter prime/T7terminator为引物进行菌落PCR,测定正确后,37℃摇菌扩增,测菌浓度至OD600为0.6时,加入IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE初步检测。SDS-PAGE检测显示其相对分子量是31KD,与预期结果一致,证明单链抗体基因成功的在大肠杆菌中得到表达。

论文目录

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验动物与虫种

2.2 抗原制备所需主要试剂

2.3 细胞复苏所需主要试剂

2.4 mRNA提取所需主要试剂

2.5 反转录所需主要试剂

2.6 重链可变区和轻链可变区基因扩增所需主要试剂

2.7 单链抗体基因构建及其表达所需主要试剂

2.8 单链抗体鉴定所需试剂

2.9 菌种与质粒载体

2.10 主要仪器

2.11 使用引物

2.12 计算机分析软件

2.13 杂交瘤细胞的复苏

2.13.1 细胞复苏

2.13.2 杂交瘤细胞的扩大培养

2.14 抗原制备

2.14.1 鸡球虫卵囊的复壮

2.14.2 卵囊的纯化

2.14.3 孢子囊的分离

2.14.4 子孢子的脱囊

2.14.5 子孢子的纯化

2.14.6 子孢子抗原的制备

2.15 杂交瘤细胞上清液效价测定

2.16 重链、轻链可变区基因的扩增

2.16.1 杂交瘤细胞总RNA的提取

2.16.2 RNA浓度、纯度的鉴定

2.16.3 RNA反转录为cDNA第一链

2.16.4 重链可变区基因的扩增

2.16.5 轻链可变区基因的扩增

2.16.6 PCR产物的测定

2.17 重链、轻链可变区基因的克隆及测序

2.17.1 轻链、重链可变区基因片段的回收

2.17.2 回收产物的鉴定

2.17.3 回收产物与载体pMD18-T连接

2.17.4 感受态细胞的制备

2.17.5 转化

2.17.6 阳性重组子的筛选

2.17.7 阳性重组子的鉴定

2.17.8 提取两阳性重组子质粒并测序

2.18 单链抗体基因的构建、表达及其表达产物的鉴定

2.18.1 单链抗体基因的构建

2.18.2 单链抗体基因酶切片段与表达载体酶切片段的获得

2.18.3 单链抗体基因酶切片段与表达载体酶切片段的回收

2.18.4 目的基因片段与表达载体的连接

2.18.5 感受态细胞的制备（方法同2.17.4）

2.18.6 转化

2.18.7 阳性重组子的筛选

2.18.8 阳性重组子的鉴定

2.18.9 诱导表达

2.18.10 表达产物鉴定

3 结果与分析

3.1 堆型艾美耳球虫的抗原制备结果

3.1.1 抗原制备过程中的镜检观测结果

3.1.2 子孢子表面抗原蛋白浓度测定

3.2 杂交瘤细胞上清液效价测定

3.3 RNA浓度、纯度的鉴定

3.3.1 紫外分光光度计检测

3.3.2 电泳检测

3.4 轻链、重链可变区PCR结果检测

3.5 轻链、重链可变区基因片段回收结果检测

3.6 轻链可变区基因的重组质粒PCR鉴定

3.7 重链可变区基因的重组质粒PCR鉴定

3.8 轻链、重链可变区基因测序结果及其分析

3.9 单链抗体基因与表达载体酶切结果

3.10 质粒PCR鉴定结果

3.11 SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳检测结果

4 讨论

5 结论

参考文献

附录A 主要试剂的配制

附录B 轻链、重链可变区测序图

附录C 由可变区基因序列推导出的氨基酸序列

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢

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