天蓝色链霉菌SRP途径蛋白转运的分子机制

论文摘要

以天蓝色链霉菌为对象，通过SRP转运体系蛋白Ffh和FtsY蛋白的生化特性研究，阐述了链霉菌细胞内蛋白膜向转运的动力机制；利用动态荧光可视技术，阐明了受体蛋白FtsY独特的膜定位机制；利用基因敲除、整合和分子杂交技术，揭示了FtsY蛋白对链霉菌形态分化和次生代谢的调控作用。本研究首次系统地研究了链霉菌SRP（signal recognition particle）途径蛋白转运的分子机理，从分子进化角度进一步解析了细菌SRP途径的保守性和多样性。首先利用生物信息学方法分析了天蓝色链霉菌ffh和ftsY基因及其编码蛋白的特征和各种性质，结果表明Ffh和FtsY蛋白是大小分别为59.1kDa和43.6kDa的单亚基蛋白，Ffh蛋白的等电点为9.27，而FtsY蛋白的等电点为4.81。两种蛋白都含有典型的GTPase蛋白的保守结构域NG结构域，区别之处在于Ffh的C端含有保守的M结构域、FtsY蛋白的N端则为特异性的跨膜疏水性结构域。多序列比对和进化树分析表明天蓝色链霉菌Ffh和FtsY蛋白与典型的模式菌大肠杆菌和枯草芽孢杆菌分属于不同的进化分支，而且从进化时间上看，依次为枯草芽孢杆菌，大肠杆菌和天蓝色链霉，表明天蓝色链霉菌SRP途径在进化史上更接近于真核生物。利用大肠杆菌表达纯化系统克隆表达了天蓝色链霉菌SRP途径Ffh，FtsY蛋白和它们的结构域，研究了它们在体外的GTPase活性，结果表明Sc-Ffh和Sc-FtsY蛋白在体外都具有GTPase活性，它们的NG结构域也具有GTPase活性，而且酶活性与全蛋白几乎相同。相比之下，纯化的Ffh-G和FtsY-G蛋白呈现很弱的GTPase活性。酶学参数测定进一步揭示，它们在酶活性方面的差异取决于它们与GTP分子结合能力的强弱，FtsY的Km为2.056μmol·l-1，其NG结构域和G结构域的Km分别为1.143μmol·l-1和9.807μmol·-1，G结构域的Km是全蛋白的五倍，因此其催化GTP的活性降低。相比较而言，Fth蛋白的G结构域Km更大，是NG结构域Km值的29倍。经放射性p32标记的GTP结合实验表明FtsY蛋白及其结构域，以及Ffh蛋白不同结构域与GTP结合能力存在差异，其中FtsY与其NG结构域有类似的GTP结合能力，而G结构域结合GTP的能力则最弱；相对Ffh蛋白而言，NG结构域的GTP结合能力也大于G结构域的作用力。另外，FtsY蛋白及其结构域，Ffh蛋白的结构域结合GTP后对蛋白酶K的消化作用都有一定的抵抗作用，其中FtsY全蛋白和两种蛋白的NG结构域的抵抗力最强，在处理30min后，仍没有完全分解，而两种蛋白的G结构域在处理30min后，则完全降解，这些结果表明蛋白抵抗蛋白酶消化与其结构有密切联系。通过定点突变技术研究了Ffh和FtsY蛋白核心功能域NG的酶活性位点。通过GTPase活性测定，酶学参数研究，GTP结合活性和蛋白酶消化等实验，发现在两种蛋白GTP结合功能域GXXGXGK中，赖氨酸残基对NG蛋白的GTPase活性，GTP结合是必需的，同时FtsY中第219位甘氨酸的突变对NG蛋白的酶学性质也有一定的影响，因此，在天蓝色链霉菌FtsY和Ffh这两种GTPase中，GXXGXGK是结合GTP的motif，而在该结构元件中，赖氨酸残基又是必不可少的活性位点。同时利用SWISS-MODEL程序模拟了FtsY和Ffh NG结构域在非水解性GTP类似物GMPPCP结合情况下形成的相互作用模型，揭示了FtsY蛋白第225位赖氨酸和Ffh蛋白第147的赖氨酸分别与GMPPCP中β和γ位的氧原子形成两个氢键，这与定点突变的实验结果非常吻合，推测模型中两个赖氨酸残基形成的氢键对于GTP的结合是必需的，因此证明了赖氨酸残基是FtsY和Ffh蛋白发挥GTPase活性不可或缺的。构建了含有来自大肠杆菌，枯草芽孢杆菌和天蓝色链霉菌ftsY基因及其功能域片段的重组突变株，利用激光共聚焦扫描显微镜观察了突变株中外源蛋白在胞内的表达和分布，发现大肠杆菌的FtsY全蛋白／NG结构域和枯草芽孢杆菌的NG结构域都能与细胞膜结合，而天蓝色链霉菌只有FtsY全蛋白能够与细胞膜结合，而其NG功能域则失去膜结合能力，这些结果表明在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌FtsY中，NG功能域负责细胞膜的结合，而在天蓝色链霉菌中其N端结构域对于FtsY的细胞膜结合功能是必不可少的，因此，在大肠杆菌，枯草芽孢杆菌和天蓝色链霉菌中SRP受体FtsY以不同的膜结合方式介导蛋白的转运，揭示了原核生物中SRP途径分子机制的多样性，同时也说明了它们在功能上的保守性。利用Red基因打靶技术构建了大肠杆菌SRP途径突变株BL21H（△ffh）和BL21Y（△ftsY），发现ffh和ftsY基因的阻断对细胞生长都产生抑制作用，特别是ftsY突变株的细胞形态变长，细胞膜微结构缺损以及细胞生长依赖于温度的变化。通过诱导表达的方法，将天蓝色链霉菌ftsY基因及其NG结构域，ffh基因的NG结构域构建到表达载体pGEX4T2中，诱导表达后发现，天蓝色链霉菌ftsY能够恢复突变株的上述的形状缺陷，但NG结构域以及ffh基因的NG结构域则没有作用。利用同源单交换的方法构建了天蓝色链霉菌ffh和ftsY基因的阻断突变株ff5和ft2。对ff5和ft2突变株的性状研究发现，ftsY基因阻断后，细胞生长受到抑制，丧失生孢能力，而且影响胞外抗生素放线菌紫素的产量，对胞内抗生素十一烷基灵菌红素则没有影响；而ffh基因阻断后，对细胞生长，形态分化和抗生素产量都没有影响。通过基因回补实验证明ftsY全长基因的补偿能够是突变株R2的各种生理缺陷恢复，但单独NG结构域则不能产生作用；相比而言，ffh基因及其NG结构域补偿对ff5突变株没有任何影响。通过研究与孢子形成相关物质和基因的含量和转录情况，对FtsY影响天蓝色链霉菌孢子形成的可能作用机制进行了阐明，发现FtsY的作用是一个级联反应，可能的机制如下：由于ftsY基因的缺失，使得负责甜菜碱合成的酶无法正常转运并定位于细胞膜上，继而影响甜菜碱的合成，导致甜菜碱结合蛋白的基因prox转录水平降低，同时使得受其调控的whiG基因的转录受到影响，水平降低，最终使whiG基因的下位基因whiH无法正常转录，阻止了细胞分化形成孢子。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 研究目的和意义
• 1.2 细菌蛋白转运的主要途径
• 1.2.1 Sec途径
• 1.2.2 Tat途径
• 1.2.3 SRP途径
• 1.2.4 三种主要途径的差别
• 1.3 蛋白经SRP途径的靶向转运
• 1.3.1 信号肽
• 1.3.2 SRP途径的分子机制
• 1.3.2.1 真核生物SRP途径
• 1.3.2.2 细菌SRP途径
• 1.3.2.3 SRP的保守性
• 1.3.3 SRP的结构与功能
• 1.3.3.1 SRP组分的结构数据
• 1.3.3.2 SRP的核心是动态的
• 1.3.3.3 M结构域结构基础
• 1.3.3.4 细菌SRP对底物的识别
• 1.3.3.5 SRP调控翻译作用
• 1.3.4 SRP受体
• 1.3.4.1 真核细胞SRP受体
• 1.3.4.2 原核细胞SRP受体
• 1.3.5 SRP组分RNA
• 1.3.6 SRP与其受体的相互作用
• 1.3.7 SRP组分与其他蛋白相互作用
• 1.3.8 SRP与靶向信号的相互作用
• 1.3.9 SRP与核糖体以及核糖体新生肽链结合
• 1.3.10 GTP在SRP途径中的作用
• 1.3.11 链霉菌SRP途径的研究进展
• 1.4 展望
• 1.5 论文立题依据和研究内容
• 1.5.1 立题依据
• 1.5.2 研究内容
• 参考文献
• 第二章 天蓝色链霉菌Ffh和FtsY的生物信息学分析
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.3 结果
• 2.3.1 ftsY基因和FtsY蛋白的序列信息分析
• 2.3.1.1 ftsY,ffh和scRNA在天蓝色链霉菌基因组中的位置
• 2.3.1.2 ftsY基因启动子
• 2.3.1.3 FtsY的基本理化性质和一级结构分析
• 2.3.1.4 FtsY亲疏水性分析
• 2.3.1.5 FtsY二级结构分析
• 2.3.1.6 FtsY三级空间结构分析
• 2.3.1.7 FtsY的亚细胞定位
• 2.3.1.8 FtsY蛋白的同源性分析
• 2.3.1.9 FtsY蛋白同源进化树构建
• 2.3.2 ffh基因和Ffh蛋白的生物信息学分析
• 2.3.2.1 ffh基因启动子分析
• 2.3.2.2 Ffh的理化性质和一级结构分析
• 2.3.2.3 Ffh亲疏水性分析
• 2.3.2.4 Ffh二级结构分析
• 2.3.2.5 Ffh三级空间结构分析
• 2.3.2.6 Ffh的亚细胞定位
• 2.3.2.7 Ffh蛋白的同源性分析
• 2.3.2.8 Ffh蛋白同源进化树构建
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 参考文献
• 第三章 FtsY和Ffh的蛋白结构与GTPase活性
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.1.1 质粒和菌株
• 3.2.1.2 主要试剂
• 3.2.1.3 主要仪器
• 3.2.2 方法
• 3.2.2.1 天蓝链霉菌基因组提取
• 3.2.2.2 感受态细胞制备
• 3.2.2.3 细胞转化
• 3.2.2.4 FtsY和Ffh及其功能域的克隆和测序
• 3.2.2.5 重叠延伸法定点突变
• 3.2.2.6 Ffh和FtsYNG结构域的定点突变
• 3.2.2.7 表达载体的构建
• 3.2.2.8 ftsY和ffh及其结构域突变体的表达和鉴定
• 3.2.2.9 蛋白亲和纯化
• 3.2.2.10 蛋白含量测定
• 3.2.2.11 GTP水解活性测定
• m和V_max测定'>3.2.2.12 K_m和V_max测定
• 3.2.2.13 光亲和交联
• 3.2.2.14 蛋白酶消化分析
• 3.2.2.15 pH对FtsY,Ffh及其功能域GTPase活性的影响
• 2+对FtsY,Ffh及其功能域GTPase活性的影响'>3.2.2.16 Mg²⁺对FtsY,Ffh及其功能域GTPase活性的影响
• 3.2.2.17 温度对对FtsY,Ffh及其功能域GTPase活性的影响
• 3.2.2.18 FtsY-NG和Ffh-NG相互作用模型的建立
• 3.3 结果
• 3.3.1 FtsY/Ffh蛋白及其功能域克隆、表达和亲和纯化
• 3.3.1.1 FtsY/Ffh蛋白及其功能域克隆
• 3.3.1.2 FtsY/Ffh蛋白及其功能域表达和亲和纯化
• 3.3.2 纯化蛋白含量测定
• 3.3.3 FtsY/Ffh蛋白及其功能域的GTPase活性
• 3.3.4 FtsY蛋白及其功能域的GTPase酶的Km和Vmax
• m和V_max'>3.3.5 Ffh功能域的GTPase的K_m和V_max
• 3.3.6 FtsY蛋白及其功能域GTPase稳定性
• 3.3.6.1 温度对FtsY蛋白及其功能域GTPase活性影响
• 3.3.6.2 pH对FtsY蛋白及其功能域GTPase活性影响
• 2+对FtsY蛋白及其功能域GTPase活性影响'>3.3.6.3 Mg²⁺对FtsY蛋白及其功能域GTPase活性影响
• 3.3.7 Ffh-NG和Ffh-G蛋白功能域GTPase稳定性
• 3.3.7.1 温度对Ffh-NG和Ffh-G GTPase活性影响
• 3.3.7.2 pH对Ffh蛋白功能域GTPase活性影响
• 2+对Ffh功能域GTPase酶活性的影响'>3.3.7.3 Mg²⁺对Ffh功能域GTPase酶活性的影响
• 3.3.8 FtsY/Ffh蛋白及其功能域结合GTP的能力
• 3.3.9 FtsY和Ffh蛋白及其功能域的蛋白酶消化试验
• 3.3.10 Ffh和FtsY蛋白NG结构域中GTP结合位点的分析
• 3.3.11 FtsY和Ffh蛋白NG结构域突变位点的确定
• 3.3.12 重叠延伸法介导的突变蛋白的PCR扩增
• 3.3.13 FtsY和Ffh NG突变基因片段的TA克隆和DNA测序
• 3.3.14 突变基因表达载体构建
• 3.3.15 突变蛋白表达和纯化
• 3.3.16 NG蛋白及其突变蛋白GTPase活性测定
• 3.3.17 FtsY和Ffh NG突变蛋白的Km和Vmax值
• 32p]GTP体外光亲和交联'>3.3.18 NG突变蛋白与[λ-³²p]GTP体外光亲和交联
• 3.3.19 NG突变蛋白的蛋白酶K消化
• 3.3.20 天蓝色链霉菌FtsY和Ffh NG蛋白相互作用模型
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 参考文献
• 第四章 SRP受体FtsY胞内定位机制
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌株和质粒
• 4.2.2 主要试剂
• 4.2.3 主要仪器
• 4.2.4 培养基
• 4.2.5 绿色荧光蛋白标记融合蛋白的PCR扩增和重组载体构建
• 4.2.6 枯草芽孢杆菌168感受态制备和转化
• 4.2.7 淀粉酶缺陷型筛选阳性克隆
• 4.2.8 重组菌株的诱导表达和SDS-PAGE分析
• 4.2.9 激光共聚焦荧光显微观察
• 4.2.10 蛋白质印迹
• 4.2.11 微流控分析芯片的荧光检测
• 4.3 结果
• 4.3.1 E.coli FtsY,S.coelicolor FtsY,B.subtilis FtsY及其功能域PCR
• 4.3.2 重组整合pFG质粒载体酶切鉴定
• 4.3.3 利用淀粉酶缺失性状筛选阳性克隆
• 4.3.4 外源整合蛋白的诱导表达和蛋白质印迹
• 4.3.5 外源蛋白表达对宿主枯草芽孢杆菌生长的抑制作用
• 4.3.6 E.coli FtsY的胞内定位
• 4.3.7 S.coelicolor FtsY的胞内定位
• 4.3.8 E.coli FtsY-NG的胞内定位
• 4.3.9 S.coelicolor FtsY-NG的胞内定位
• 4.3.10 E.coli FtsY-A与S.coelicolor FtsY-NG融合蛋白的胞内定位
• 4.3.11 E.coli FtsY-NG与S.coelicolor FtsY-N融合蛋白的胞内定位
• 4.3.12 B.subtilis FtsY-NG的胞内定位
• 4.3.13 B.subtilis FtsY-NG与S.coelicolor FtsY-N融合蛋白的胞内定位
• 4.3.14 B.subtilis FtsY-N与S.coelicolor FtsY-NG融合蛋白的胞内定位
• 4.3.15 GFP蛋白的定位
• 4.3.16 细胞定位的统计分析
• 4.4 讨论
• 4.5 本章小结
• 参考文献
• 第五章 S.coelicolor FtsY和Ffh及其NG结构域对Ecoli突变株的补偿
• 5.1 引言
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 材料
• 5.2.1.1 菌株和质粒
• 5.2.1.2 主要试剂
• 5.2.1.3 培养基
• 5.2.2 方法
• 5.2.2.1 PCR片段的制备
• 5.2.2.2 PCR片段的电转化
• 5.2.2.3 大肠杆菌基因组提取
• 5.2.2.4 重组质粒的鉴定
• 5.2.2.5 质粒pKD46的消除
• 5.2.2.6 E.coli生长曲线测定
• 5.2.2.7 E.coli细胞形态的透射电子显微镜分析
• 5.2.2.8 E.coli细胞膜蛋白的SDS-PAGE
• 5.2.2.9 ffh和ftsY基因及其NG结构域补偿载体的构建
• 5.2.2.10 补偿载体的转化和诱导表达
• 5.3 结果
• 5.3.1 基因敲除PCR片段的制备
• 5.3.2 电转化法构建突变株
• 5.3.3 E.coli ffh和ftsY基因阻断突变株PCR鉴定
• 5.3.4 E.coli ffh和ftsY基因阻断突变株的测序鉴定
• 5.3.5 S.coelicolor FtsY和Ffh及其功能域补偿载体构建和SDS-PAGE
• 5.3.6 阻断突变株和补偿后突变株生长曲线比较
• 5.3.7 大肠杆菌SRP阻断突变株和补偿后细胞形态的变化
• 5.3.8 温度对大肠杆菌SRP阻断突变株和补偿后菌株生长的影响
• 5.3.9 大肠杆菌SRP阻断突变株和补偿后膜蛋白SDS-PAGE分析
• 5.3.10 大肠杆菌SRP阻断突变株和补偿后细胞微结构
• 5.4 讨论
• 5.5 本章小结
• 参考文献
• 第六章 SRP受体FtsY蛋白对链霉菌形态分化和代谢的调控
• 6.1 引言
• 6.2 材料和方法
• 6.2.1 菌种和载体
• 6.2.2 主要试剂
• 6.2.3 主要仪器
• 6.2.4 主要培养基
• 6.2.5 方法
• 6.2.5.1 摇瓶培养
• 6.2.5.2 抗生素发酵
• 6.2.5.3 S.coelicolor孢子悬液制备
• 6.2.5.4 S.coelicolor原生质体制备
• 6.2.5.5 S.coelicolor基因组DNA的提取
• 6.2.5.6 链霉菌质粒DNA的提取
• 6.2.5.7 S.coelicolor的转化和再生
• 6.2.5.8 天蓝色链霉菌生物量测定
• 6.2.5.9 抗生素放线菌紫素（Actinorhodin）的测定
• 6.2.5.10 十一烷基灵菌红素（Undecylprodigiosin）的测定
• 6.2.5.11 基因敲除和突变株筛选
• 6.2.5.12 用于基因功能互补的质粒构建
• 6.2.5.13 Southern杂交
• 6.2.5.14 扫描电镜样品制备
• 6.2.5.15 甜菜碱测定
• 6.2.5.16 S.coelicolor RNA提取
• 6.2.5.17 RNA甲醛变性电泳
• 6.2.5.18 Northern杂交
• 6.2.5.19 DNA双链探针的制备
• 6.3 结果
• 6.3.1 天蓝色链霉菌ffh和ftsY基因阻断载体构建
• 6.3.2 天蓝色链霉菌ffh和ftsY阻断突变株的筛选及PCR鉴定
• 6.3.3 ffh和ftsY基因破坏的Southern杂交验证
• 6.3.4 ffh和ftsY基因互补载体的构建
• 6.3.5 ffh和ftsY基因及其功能域互补突变株的筛选和PCR鉴定
• 6.3.6 ffh和ftsY破坏子及互补菌株的形态变化
• 6.3.7 ffh和ftsY阻断突变株及回补菌株的生长曲线和抗生素产量变化
• 6.3.7.1 ffh阻断突变株及其互补菌株的生长曲线和抗生素产量
• 6.3.7.2 ftsY阻断突变株及其互补菌株的生长曲线和抗生素产量测定
• 6.3.8 S.coelicolor M145,ft2,ft2C1和ft2C2胞内甜菜碱含量
• 6.3.9 探针标记所需模板的PCR制备
• 6.3.10 prox,whiG,whiB和whiH基因的转录分析
• 6.4 讨论
• 6.5 本章小结
• 参考文献
• 结论与展望
• 缩略表
• 附录测序报告
• 攻读博士学位期间发表的论文及成果
• 致谢