大曲华根霉（Rhizopus chinensis）固态发酵表达酯合成脂肪酶的研究

论文摘要

华根霉（Rhizopus chinensis CCTCC M201021）是从白酒大曲中分离得到的一株丝状真菌,其在固态发酵过程中能够合成多种酯合成脂肪酶。为研究华根霉固体发酵产酯合成脂肪酶的特点和形成机理,本论文开展了系统的研究。通过优化华根霉固态发酵的培养条件和参数,大量制备菌体结合酯合成脂肪酶,然后对这些脂肪酶蛋白进行分离纯化和酶学性质研究,并在蛋白质分子水平上与液体培养条件下的脂肪酶进行对比,发现和确认了固态发酵所特有的酯合成脂肪酶,并详细分析固态发酵特殊的环境条件对特征性脂肪酶产生的影响,揭示了诱导特征性酯合成脂肪酶表达的关键因素。具体结果如下:（1）华根霉固体发酵产全细胞酯合成脂肪酶的培养基和培养条件优化为进一步提高华根霉菌体结合脂肪酶的生产水平,获得一定数量的目的酶用于后续研究,对发酵培养基各主要成分含量和发酵条件进行了单因素考察和优化。以脂肪酶合成活性为指标,得到的培养基组成为（w/w）:小麦18%,麸皮12%,乳糖2%（补充碳源）,蛋白胨2%（补充氮源）,橄榄油2%（v/w,诱导物）,K2HPO40.3%,MgSO4·7H2O0.07%;最佳产酶条件为:起始水分含量70%,接种量106孢子/g干基,培养温度30℃,初始pH值6.5,培养时间72 h。优化后的培养基将菌体结合酯合成脂肪酶的活力提高至24432 U/kg干基,为优化前培养基酶活的4.1倍。（2）华根霉固态发酵酯合成脂肪酶的分离纯化为在蛋白质水平上研究固态发酵表达的酯合成脂肪酶,需要对其进行分离纯化。将R.chinensis固体发酵的细胞破碎后,利用Triton X-100提取胞膜粗蛋白,然后经过硫酸铵沉淀、丁基疏水层析和Superdex 75凝胶过滤层析得到两个酯合成脂肪酶同工酶,分别命名为SSL1和SSL2。SSL1的分子量约为64 kDa,SSL2的分子量是33 kDa。利用相同的步骤纯化R.chinensis液态发酵的酯合成脂肪酶,也得到了两个脂肪酶同工酶,分别是SML1和SML2。通过N端序列和肽质量指纹图谱比对,发现SSL2是固体发酵和液体发酵的共有蛋白质,而SSL1则可能是与固体发酵相偶联的特征性脂肪酶,而且SSL1与已报道的根霉脂肪酶的同源性很低,应该是一种新型的脂肪酶。（3）固态发酵特征性酯合成脂肪酶（SSL1）的生化性质研究以水解活性为表征,对纯化的固态发酵特征性酯合成脂肪酶（SSL1）的酶学性质进行研究,结果表明,SSL1水解活性的最适反应温度是40℃,其在50℃以下保留1 h仍然能维持原始活性的80%以上;最适反应pH为8.0,在pH 6.5～8.0的条件下也比较稳定。K+显著提高了SSL1的水解活性,而Cu2+和Hg2+则完全抑制了其活性。纯化的SSL1对三氯甲烷、正己烷等有机溶剂有较好的耐受性。底物特异性研究表明,该脂肪酶对中长链的脂肪酸酯具有较高的水解活性,对硝基苯酚棕榈酸酯(C16)是其最适底物。以合成活性为表征,纯化的SSL1最适pH记忆是7.5,最适反应温度是30℃。在有机相中催化合成脂肪酸乙酯的研究表明,以乙醇为酰基受体时,SSL1的最佳酰基供体是肉豆蔻酸,而且对于碳链长度大于8的中长链脂肪酸,该脂肪酶也表现出较高的酯合成的能力。将SSL1与液态发酵特殊的酯合成脂肪酶（SML1）进行对比,发现SSL1在热稳定性及有机溶剂耐受性等方面显著优于SML1。另外,两者在金属离子的影响、水解底物特异性、pH记忆以及合成反应的最佳酰基供体等酶学特性和催化特性上也存在一定差异。（4）抗SSL1兔多克隆抗体的制备以及SSL1特征性的验证为了验证SSL1是固体发酵过程中产生的特征性酯合成脂肪酶,利用纯化的SSL1为抗原免疫新西兰大白兔制备抗SSL1多克隆抗体,经4次免疫后,血清效价达1:10000。多克隆抗体经Protein A亲和柱层析后,纯度完全符合检测要求。利用免疫印迹分析固态发酵和液态发酵的蛋白表达情况,结果表明,多克隆抗体能够与固体发酵的胞内和胞膜粗蛋白发生特异性反应,证明SSL1存在于固体发酵的细胞内和细胞膜上;但是抗SSL1多克隆抗体不能与液体发酵的任何组分（细胞内、细胞外和细胞膜）发生特异性反应,说明SSL1在液体发酵过程中没有表达。（5）固态发酵非特征性酯合成脂肪酶（SSL2）的生化性质研究以水解活性为表征,对纯化的固态发酵非特征性酯合成脂肪酶（SSL2）的酶学性质进行研究,结果表明,SSL2水解活性的最适反应温度是40℃,在35℃以下较为稳定;最适反应pH为8.5,在pH 5.5～7.0的环境中也较为稳定。Mn2+显著提高了该脂肪酶的水解活性,而Cu2+,Zn2+,Fe2+,Hg2+和Fe3+则强烈抑制了这一活性。纯化的SSL2对甲醇、乙醇、正己烷和异辛烷等有机溶剂有较好的耐受性,而其他溶剂使脂肪酶失活严重。底物特异性研究表明,SSL2对对硝基苯酚月桂酸酯(C12)的脂肪酸链长特异性最高,对中长链的脂肪酸酯也具有较高的水解活性。以合成活性为表征,纯化的SSL2的最适pH记忆和反应温度分别是6.0和30℃;在有机相中催化合成反应的脂肪酸和脂肪醇的底物特异性研究表明,该酶的最适底物脂肪酸是正辛酸,最适底物脂肪醇是正丁醇。将SSL2与液态发酵非特征性酯合成脂肪酶SML2进行对比,发现两者的酶学特性和催化特性基本相同,但是SSL2比SML2最适反应温度更高。另外,两者在金属离子的影响、有机溶剂耐受性等酶学特性上也存在些许差异。（6）诱导SSL1表达的固态发酵关键因素的考察结合Western blotting和间接Elisa法研究固态发酵特殊的环境因素对SSL1的诱导作用,发现界面的存在和较高的培养温度皆不是诱导SSL1产生的关键参数。在平板培养和标准固态发酵中的各层菌丝体中,SSL1都在营养菌丝体中高量表达,而气生菌体以及菌膜都不利于产SSL1,所以气生菌丝体的存在可能与SSL1的表达没有直接联系。低水活度是诱导SSL1产生的一个关键因素,降低培养基的水活度能够诱导SSL1生成,并且与调节水活度的化合物无关;而且在发酵后培养的过程中,降低水活度仍然可以提高SSL1的表达量。生长阻力是诱导SSL1表达的第二个重要因素,增加生长阻力能够明显提高SSL1的表达量。

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摘要

ABSTRACT

第一章绪论

1.1 固态发酵概述

1.2 固态发酵产酶的研究进展

1.2.1 固态发酵在发酵水平上的研究进展

1.2.2 固态发酵在蛋白质水平上的研究进展

1.3 根霉脂肪酶的固态发酵和分离纯化

1.3.1 根霉脂肪酶概述

1.3.2 根霉脂肪酶的固态发酵

1.3.3 根霉脂肪酶纯化

1.4 固体发酵环境条件对丝状真菌产特殊蛋白质的影响

1.5 本论文的立题意义和主要研究内容

1.5.1 本论文的研究目的和立题意义

1.5.2 本论文的研究思路与主要研究内容

第二章华根霉固态发酵产全细胞合成活性脂肪酶的培养条件研究

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 菌种

2.2.2 主要试剂

2.2.3 主要仪器

2.2.4 研究方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 培养基组分以及培养条件对华根霉菌体结合酯合成脂肪酶发酵的影响

2.3.2 固态发酵产菌体结合酯合成脂肪酶进程

2.4 小结

第三章华根霉固态发酵酯合成脂肪酶的分离纯化和物理特性

3.1前言

3.2 材料与方法

3.2.1 菌种

3.2.2 培养基

3.2.3 主要试剂

3.2.4 主要仪器

3.2.5 溶液配制

3.2.6 研究方法

3.2.7 脂肪酶的SDS-PAGE分析

3.2.8 N-末端氨基酸序列的测定

3.2.9 肽质量指纹谱分析

3.3 结果与讨论

3.3.1 华根霉脂肪酶活力分布

3.3.2 Triton X-100浓度对膜结合脂肪酶提取效果的影响

3.3.3 华根霉固态发酵产酯合成脂肪酶的纯化

3.3.4 华根霉液态发酵产酯合成脂肪酶的纯化

3.3.5 脂肪酶N端氨基酸序列分析

3.3.6 肽质量指纹谱分析

3.4 小结

第四章华根霉固态发酵特征性酯合成脂肪酶的生化性质

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 菌种

4.2.2 培养基

4.2.3 主要试剂

4.2.4 主要仪器

4.2.5 溶液的配制

4.2.6 研究方法

4.2.7 脂肪酶水解活性的研究

4.2.8 脂肪酶合成活性的研究

4.2.9 兔抗菌体蛋白血清的制备

4.2.10 ELISA法检测免疫血清的效价

4.2.11 抗体的纯化

4.2.12 免疫印迹分析

4.3 结果与讨论

4.3.1 纯化的脂肪酶的水解酶学性质

4.3.2 纯化的脂肪酶的合成酶学性质

4.3.3 脂肪酶SSL1、SML1比较

4.3.4 兔抗菌体蛋白血清效价的测定及抗体的纯化

4.3.5 SSL1特征性的验证

4.4 小结

第五章华根霉固态发酵非特征性酯合成脂肪酶的生化性质

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 菌种

5.2.2 培养基

5.2.3 主要试剂

5.2.4 主要仪器

5.2.5 研究方法

5.2.6 脂肪酶水解活性的研究

5.2.7 脂肪酶合成活性的研究

5.3 结果与讨论

5.3.1 SSL2水解酶学性质

5.3.2 SSL2合成酶学性质

5.3.3 脂肪酶SSL2、SML2比较

5.4 小结

第六章诱导华根霉固体发酵特征性酯合成脂肪酶表达的关键因素的研究

6.1 前言

6.2 材料与方法

6.2.1 菌种

6.2.2 主要试剂

6.2.3 主要仪器

6.2.4 溶液配制

6.2.5 培养基和培养方法

6.2.6 菌体收集与菌体结合脂肪酶的制备

6.2.7 检测方法

6.2.8 蛋白含量标准曲线的绘制

6.3 结果与讨论

6.3.1 间接Elisa法测定SSL1含量标准曲线的建立

6.3.2 液体发酵中模拟固态发酵条件对诱导SSL1的影响

6.3.3 平板培养中模拟固体发酵条件对诱导SSL1的影响

6.4 小结

主要结论

论文创新点

参考文献

致谢

附录:作者在学期间发表的论文

大曲华根霉（Rhizopus chinensis）固态发酵表达酯合成脂肪酶的研究

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