论文摘要
背景与目的:端粒是位于真核细胞染色体末端的DNA重复结构,由端粒DNA重复序列与端粒相关蛋白组成,具有维持染色体结构完整性的作用。端粒酶是具有特殊逆转录酶活性的核糖核蛋白复合物,它的活化可以使端粒不断复制延长,从而使细胞“逃脱”衰老和凋亡获得永生化,这是导致许多恶性肿瘤发生的最关键的条件。端粒酶在人类正常细胞（生殖细胞、胚胎细胞除外）和组织中几乎不表达,而在恶性肿瘤及永生化细胞中活性显著升高,其在人类恶性肿瘤总的表达率为85%左右。端粒酶由端粒RNA成分（TR）、端粒酶逆转录酶（TERT）和端粒相关蛋白1（TP1）3个亚单位组成,其中TERT是端粒酶的催化亚单位,对端粒酶活性起着重要作用,与端粒酶活性呈正相关;其他2个亚基均不能作为端粒酶的活性指标。近年来兴起的RNA干扰技术因为能特异、高效的使靶基因沉默,而成为基因功能研究的强有力工具。本研究选用高表达hTERT的乳腺癌细胞T47D,利用RNAi干扰技术封闭hTERT基因的表达,检测癌细胞的端粒酶活性变化以及细胞生长增殖情况,以期为抗肿瘤治疗提供新思路。方法:选择hTERT基因较高表达的人乳腺癌细胞系T47D为研究对象。siRNA表达载体选择TaKaRa（宝生物）公司的pBAsi-hU6-Neo（BamHⅠ/HindⅢ）载体。首先,从hTERT基因序列中选取4段18nt的片断,并取其中一段序列随机打乱碱基顺序作为阴性对照,设计并合成10条互补的DNA序列,经退火形成双链,连接质粒载体,构建pBAsi-hU6-Neo/siRNA1、pBAsi-hU6-Neo/siRNA2、pBAsi-hU6-Neo/siRNA3、pBAsi-hU6-Neo/siRNA4和pBAsi-hU6-Neo/SiRNA2negative等五种质粒,转化所得质粒到大肠杆菌中,经过克隆、筛选、扩增,提取质粒,酶切并测序鉴定。然后将纯化质粒转染到T47D细胞中,在hU6启动子作用下,质粒在细胞内转录生成具有3′突出的发卡RNA。G418筛选转染成功的细胞,进行克隆化,扩大培养。采用RT-PCR法检测hTERT的mRNA表达:western blot检测hTERT蛋白的表达;TRAP-ELISA法检测细胞的端粒酶活性;选用MTT法绘制细胞生长曲线观察细胞的增殖活性变化,并以流式细胞术检测细胞周期变化。结果:1.成功地构建了五种能够表达siRNA的质粒pBAsi-hU6-Neo /siRNA,通过测序分析,证实插入载体的核苷酸序列和设计完全符合。2.转染纯化后的质粒到T47D细胞中,经G418筛选出了五种转染成功的细胞:T47D/siRNA1、T47D/siRNA2、T47D/siRNA3、T47D/siRNA4和T47D/siRNA2negative。3.RT-PCR和westernblot检测结果显示T47D/siRNA2、T47D/siRNA3和T47D/siRNA4三组细胞的hTERTmRNA和hTERT蛋白表达量较对照T47D细胞（T47Dcontrol）表达量明显降低（P＜0.05）;而T47D/siRNA1和T47D/siRNA2negative组细胞同T47Dcontrol细胞则无明显差别。4.TRAP-ELISA法检测表明T47D/siRNA2、T47D/siRNA3和T47D/siRNA4三组细胞端粒酶活性较T47Dcontrol细胞明显降低（P＜0.05）;而T47D/siRNA1和T47D/siRNA2negative组细胞的端粒酶活性同T47Dcontrol细胞相比差别不明显。5.MTT绘制的生长曲线显示T47D/siRNA2、T47D/siRNA3和T47D/siRNA4三组细胞生长速度较T47Dcontrol细胞明显降低;T47D/siRNA1生长速度也有减缓,T47D/siRNA2negative组细胞增殖能力同T47Dcontrol细胞则无明显差别。6.流式细胞术检测结果表明T47D/siRNA1、T47D/siRNA2、T47D/siRNA3和T47D/siRNA4三组细胞G0/G1期细胞比例增高,而S期细胞比例降低,同T47Dcontrol细胞相比,差异明显（P＜0.05）;而T47D/siRNA1和T47D/siRNA2negative组细胞同T47Dcontrol细胞相比细胞周期没有明显变化。结论:1.siRNA能够高效地封闭乳腺癌T47D细胞hTERT基因的表达。2.hTERT在乳腺癌细胞中的表达下降能显著降低细胞的端粒酶活性。3.hTERT在乳腺癌中的表达下降能降低细胞的增殖能力。
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