高产β-半乳糖苷酶乳酸菌的筛选、基因克隆与表达

论文摘要

随着人们生活水平提高,牛奶等奶制品逐渐进入人们的饮食生活中。它们为人类提供丰富的蛋白质、维生素以及微量元素,为人类健康提供营养保证。然而,有些人群在饮用牛奶或者奶制品过程中会发生肠鸣、腹胀、腹痛、排气、不适、腹泻等乳糖不耐受症症状。由此乳糖不耐受症患者就不能直接食用各类鲜奶制品,为其生活带来诸多不便。一般将乳糖不耐受症分为先天性乳糖不耐受症、原发性乳糖不耐受症（又称成人型β-半乳糖苷酶缺乏）、继发性乳糖不耐受症三类。根据病因不同,其治疗方法也不尽相同。一般采用两种方法治疗乳糖不耐受症,首先是改进饮食习惯,可以通过每天摄入一定量乳糖,并逐步增加乳糖的摄入量,再配合其他不含乳糖食物摄入,这样可以使乳糖不耐受症患者的症状得到一定缓解。其次是生产低乳糖的乳制品,一般采用酶法及机械超滤法去除或破坏牛乳中乳糖。其中第一种方法简单易行,但不能从根本上解决问题；而第二种方法可以避免乳糖的大量摄入,能有效解决乳糖不耐受症。本研究以第二种方法为启迪,寻找能够分解乳糖微生物。一般能够产生β-半乳糖苷酶的微生物均能够降低乳制品中乳糖含量。通过微生物纯培养法结合X-gal实验,筛选产β-半乳糖苷酶的乳酸菌。本研究通过基因工程技术手段对β-半乳糖苷酶基因进行克隆与表达,研究其酶学性质以及产酶条件,从而在不同层面探寻解决乳糖不耐受症的方法。本研究以云南省个旧,建水,绿春,红河,元阳,开远等地区采集豆豉样品,运用微生物纯培养技术对样品中乳酸菌进行筛选,同时通过X-gal显色培养, 最终筛选产β-半乳糖苷酶的乳酸菌菌株,并且对它们产β-半乳糖苷酶的能力进行判定。通过改良CTAB法提取筛选得到的23株高产β-半乳糖苷酶菌株的基因组DNA,利用PCR技术扩增这些菌株的16SrRNA基因,通过分子生物学鉴定表明,23株产β-半乳糖苷酶菌株分属于Lactobacillus brevis、Pediococcus acidilactici、Lactobacillus plantarum、Enterococcus faecium、Pediococcus pentosaceus、Weissella confusa六个菌种。通过对这些菌株β-半乳糖苷酶活性测定发现,GJ-1-3菌株β-半乳糖苷酶酶活最高,达到5.28 U/mL。经16S rRNA基因鉴定结果表明,该菌株为短乳杆菌（Lb. brevis）。除THU-HA NGUYEN等筛选得到能够产β-半乳糖苷酶的短乳杆菌菌株,但缺乏该种乳酸菌编码β-半乳糖苷酶的相关基因的研究报告,因此本实验通过分子克隆手段对该菌株来源的β-半乳糖苷酶基因进行克隆并实施大肠杆菌的表达研究,最终实现Lb. brevis来源的β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌BL21进行异源性表达,酶活达到40 U/mL,比原始菌株提高近7倍。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩写词表
• 第一章 绪论
• 1.1 豆豉
• 1.1.1 豆豉的分布情况
• 1.1.2 豆豉的发酵工艺
• 1.1.3 豆豉发酵的微生物多样性
• 1.1.4 豆豉中的生理活性物质
• 1.2 乳酸菌及其主要生理功能
• 1.2.1 营养调节功能
• 1.2.2 肠道微生态调节功能
• 1.2.3 免疫调节功能
• 1.2.4 食物过敏调节功能
• 1.2.5 乳酸菌的其他生理机能
• 1.3 B-半乳糖苷酶的研究现状
• 1.3.1 β-半乳糖苷酶简介
• 1.3.2 β-半乳糖苷酶的生化性质
• 1.3.3 β-半乳糖苷酶来源
• 1.3.4 β-半乳糖苷酶应用
• 1.4 本研究的目的与意义
• 1.5 研究内容
• 1.6 技术路线
• 第二章 高产β-半乳糖苷酶乳酸菌的分离筛选及鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料及方法
• 2.2.1 不同地区豆豉样品采集一览
• 2.2.2 部分豆豉样品形态
• 2.2.3 实验仪器
• 2.2.4 实验试剂
• 2.2.5 培养基及试剂配制
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 豉中乳酸菌分离
• 2.3.2 产β-半乳糖苷酶乳酸菌筛选
• 2.3.3 β-半乳糖苷酶活性测定
• 2.3.4 高产β-半乳糖苷酶菌株的分子生物学鉴定
• 2.3.5 两株短乳杆菌菌株的系统进化分析
• 2.4 结果
• 2.4.1 高产β-半乳糖苷酶乳酸菌的分离、筛选与酶活测定
• 2.4.2 分离得到乳酸菌的分子生物学鉴定
• 2.4.3 GJ1-3、GJ1-2系统进化分析
• 2.5 讨论
• 2.6 本章小结
• 第三章 β-半乳糖苷酶基因的克隆与表达
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 实验菌株与载体
• 3.2.2 实验仪器
• 3.2.3 实验用试剂
• 3.2.4 实验用培养基及试剂配制
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 β-半乳糖苷酶基因扩增
• 3.3.2 β-半乳糖苷酶基因的克隆与核苷酸序列分析
• 3.3.3 阳性菌株重组质粒提取
• 3.3.4 重组质粒确认
• 3.3.5 酶切产物回收
• 3.3.6 β-半乳糖苷酶目的基因的重组表达载体构建
• 3.3.7 β-半乳糖苷酶重组菌株构建
• 3.3.8 阳性菌株筛选
• 3.3.9 重组质粒提取
• 3.3.10 转化感受态大肠杆菌BL21
• 3.3.11 阳性菌落筛选
• 3.3.12 β-半乳糖苷酶重组菌株的诱导表达
• 3.4 结果
• 3.4.1 GJ1-3来源β-半乳糖苷酶基因的克隆
• 3.4.2 短乳杆菌GJ1-3菌株由来β-半乳糖苷酶的基因表达
• 3.5 讨论
• 3.6 本章小结
• 第四章 B-半乳糖苷酶的分离纯化与酶学特性研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 实验样品
• 4.2.2 实验仪器
• 4.2.3 实验试剂
• 4.2.4 实验用试剂配制
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 β-半乳糖苷酶重组菌株E.coli BL21/pET28a-bgaB-18的诱导表达
• 4.3.2 β-半乳糖苷酶重组菌株E.coli BL21/pET28a-bgaB-18蛋白纯化
• 4.3.3 重组β-半乳糖苷酶的SDS-PAGE电泳
• 4.3.4 重组β-半乳糖苷酶native-PAGE电泳
• 4.4 重组大肠杆菌B-半乳糖苷酶酶学性质
• 4.4.1 β-半乳糖苷酶的最适温度确定
• 4.4.2 β-半乳糖苷酶的最适pH确定
• 4.4.3 β-半乳糖苷酶的热稳定性测定
• 4.4.4 β-半乳糖苷酶的pH稳定性测定
• 4.4.5 金属离子对β-半乳糖苷酶活性的影响
• 4.4.6 β-半乳糖苷酶的Km与Vmax测定
• 4.5 结果
• 4.5.1 重组β-半乳糖苷酶SDS-PAGE电泳图谱
• 4.5.2 重组β-半乳糖苷酶native-PAGE电泳图谱
• 4.5.3 重组β-半乳糖苷酶最适反应温度
• 4.5.4 重组β-半乳糖苷酶最适pH
• 4.5.5 重组β-半乳糖苷酶的热稳定性
• 4.5.6 β-半乳糖苷酶的pH稳定性
• 4.5.7 金属离子对重组β-半乳糖苷酶活性的影响
• m与V_max测定'>4.5.8 重组β-半乳糖苷酶的K_m与V_max测定
• 4.6 讨论
• 4.7 本章小结
• 第五章 β-半乳糖苷酶重组菌株培养条件探讨
• 5.1 引言
• 5.2 实验材料
• 5.2.1 实验样品
• 5.2.2 实验用培养基及试剂配制
• 5.2.3 实验试剂
• 5.2.4 培养基及试剂配制
• 5.3 试验方法
• 5.3.1 碳源对Lb.brevis GJ1-3由来β-半乳糖苷酶活性影响
• 5.3.2 氮源对Lb.brevis GJ1-3由来β-半乳糖苷酶活性影响
• 5.3.3 IPTG对Lb.brevis GJ1-3由来β-半乳糖苷酶活性影响
• 5.3.4 IPTG诱导时间对Lb.brevis GJ1-3由来β-半乳糖苷酶活性影响
• 5.3.5 振荡速度对Lb.brevis GJ1-3由来β-半乳糖苷酶活性影响
• 5.4 结果
• 5.4.1 碳源对Lb.brevis GJ1-3由来β-半乳糖苷酶活性影响
• 5.4.2 氮源对Lb.brevis GJ1-3由来β-半乳糖苷酶活性影响
• 5.4.3 IPTG浓度对Lb.brevis GJ1-3由来β-半乳糖苷酶活性影响
• 5.4.4 IPTG诱导时间对Lb.brevis GJ1-3由来β-半乳糖苷酶活性影响
• 5.4.5 振荡培养速度对Lb.brevis GJ1-3来源β-半乳糖苷酶产量的影响
• 5.5 讨论
• 5.6 本章小结
• 第六章 总结
• 6.1 传统发酵豆豉由来具有产B-半乳糖苷酶乳酸菌多样性
• 6.2 B-半乳糖苷酶产生菌筛选方法特点
• 6.3 LB.BREVIS GJ1-3由来B-半乳糖苷酶基因组及酶学特性
• 6.4 E.COLIBL21/PET28A-BGAB-18菌株B-半乳糖苷酶产酶条件
• 6.5 创新点
• 6.6 存在不足
• 6.7 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录A 攻读硕士期间发表论文目录