论文摘要
三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）是我国最主要的育珠母蚌,所产珍珠色泽鲜艳、细腻光滑,是淡水珍珠生产用的首选蚌种。目前,珍珠产量不断增长,但同时养殖淡水珍珠的质量却日益退化,而其中很重要的原因是目前对珍珠生长的分子遗传机制的认识不足,特别是对Ca2+代谢调控下的珍珠贝和珍珠生长的分子基础和机理的研究目前尚未阐明。开展珍珠生长的分子机制研究不仅可以促进珍珠科学理论研究的深入发展,还可以为其产业发展中珍珠培育技术的创新和发展提供指导,因此是当前育珠业亟待研究的课题之一。鉴于以上背景,本论文主要包括以下两部分研究内容:一、三种不同环境因子对三角帆蚌钙代谢影响的研究本研究采用非损伤微测技术（Non-invasive micro-test technology,NMT）和激光共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope,CLSM）技术在细胞水平上对三角帆蚌外套膜细胞外Ca2+的运动方向与速率、细胞内Ca2+囤积进行测定。试验将3只育珠蚌的外套膜培养组织或细胞分成3个组（3个重复/组）,每组培养液中分别添加不同浓度的Ca2+（对照组、0.5、1.25、3 mmol/L）、不同浓度的VD3（对照组、50、100、500 IU/L）,及置于不同温度下（20、26、30℃）培养。研究结果表明,添加Ca2+时,细胞外Ca2+流动方向是从外排逐步变为内流,并随浓度增大,Ca2+流动速度增大,细胞内部的荧光信号增强,其中添加3 mmol/L组Ca2+内流速度最大,细胞内部信号最强,相比其余组差异显著（P<0.05）;添加VD3时,Ca2+的流动方向也从外排逐步转变成向外套膜细胞方向内流,并且随着浓度增加,Ca2+流动速度增大,细胞内部的Ca2+荧光信号增大,其中500 IU/L组相比对照组差异显著（P<0.05）;温度对三角帆蚌外套膜细胞Ca2+的代谢也有重要作用,随着温度的升高,Ca2+运动方向的变化从外排到内流再外排（P<0.05）,细胞内部Ca2+信号也不断增强,其中在温度26℃的条件下,Ca2+内流速度最大,细胞内部信号最强（P<0.05）。二、三种不同环境因子对三角帆蚌碱性磷酸酶（ALP）基因表达、酶活性性的影响及其与钙代谢水平的相关分析碱性磷酸酶（ALP）与珍珠质的形成关系密切,在钙转运和珍珠生物矿化中起着重要的作用,因此本试验探讨了ALP对三角帆蚌体内钙代谢的影响。试验通过巢式及3’-RACE PCR技术获取ALP基因3’端序列,并进行生物信息学分析,利用荧光Real-time Q-PCR,运用双标准曲线法分析ALP mRNA在外套膜外表皮、腮、内脏团、斧足、珍珠囊中表达水平的差异,以及在不同Ca2+、VD3、温度培养条件下的ALP表达差异和酶活性的差异。试验得到ALP基因3’端序列长度为924 bp碱基,该基因在三角帆蚌珍珠囊内表达量最高,与其他组织比较,有显著差异（P<0.05）。三种培养条件下的外套膜外表皮组织中ALP基因表达以及酶活性差异综合分析表明,高浓度的Ca2+与VD3,以及26℃条件下,ALP基因表达及酶活性最高（P<0.05）,而ALP基因mRNA在三角帆蚌外套膜外表皮中大量存在,有促进钙代谢的作用,推测ALP基因高表达可促进Ca2+在细胞内大量的沉积,有利于Ca2+的储存,促进蚌的贝壳与珍珠质的沉积。本研究为三角帆蚌外套膜细胞的钙代谢机制研究提供了试验依据,对于阐明珍珠形成机理,提高珍珠质量有着重要意义。