论文摘要
研究背景类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA）是以关节组织慢性炎症性病变为主要临床表现的自身免疫性疾病,其患病率约为0.3%～1%。目前该病病因尚未完全明确,感染、遗传、雌激素水平、环境、劳累、外伤等因素均可能诱导RA发生。若治疗不及时、不规范,滑膜炎的持久、反复发作可导致关节内软骨和骨的破坏,引起严重关节畸形、关节功能障碍,从而严重影响RA患者的生活质量。西医对RA的治疗目标主要是缓解症状、控制病情发展,从而改善患者的生活质量。目前临床上用于治疗RA的药物主要有非甾体抗炎药、慢作用抗风湿药及糖皮质激素,这些药物可以快速起效,但是长期使用均可导致严重的不良反应。目前已有大量的临床研究显示一些传统中医药制剂以及中西医联合疗法对RA的治疗效果比单独使用西药治疗更让人满意。乌头汤是一个应用历史悠久的经典方剂,由川乌、麻黄、白芍、甘草及黄芪组成,临床上主要用于RA、风湿性关节炎等疾病的治疗。乌头汤的疗效确切,已使广大的RA患者获益。然而,处方中的“君药”及“臣药”的川乌及麻黄均具有严重毒副作用,因此,必须通过科学手段阐明乌头汤产生疗效的物质基础和作用机制,以提高药物疗效和减轻毒副作用。药代动力学着重研究研究药物产生临床疗效的物质基础及体内过程,药代动力学参数可用于指导临床用药、评价药品的安全性、促进新药的开发研究等。由于中药的化学成分比较复杂,目前,中药药代动力学研究常选取一种或几种代表成分作为研究对象,进而阐述中药或方剂的药代动力学特征。选取具有代表性的指标成分进行针对性的研究,是研究乌头汤药代动力学特征的关键。我们采用以下两个条件为基础选择具有代表性的指标成分：1)该物质的药理活性应当与乌头汤的药理作用一致；2)该物质在乌头汤提取液中应当具有相对较高的含量。川乌为乌头汤的“君药”,是乌头汤产生临床疗效不可或缺的组分。众所周知,乌头类生物碱是川乌中的主要药理活性成分,包括双酯二萜类生物碱及单酯二萜类生物碱。双酯二萜类生物碱受热不稳定,煎煮过程中,易水解生成对应的单酯二萜类生物碱。已有文献报道附子水煎液加热30mmin,即有大部分双酯二萜类生物碱发生水解。乌头汤的制备需要较长时间的煎煮,可导致大部分双酯二萜类生物碱（乌头碱、次乌头碱、新乌头碱）发生水解,显然不符合我们对目标化合物选择的条件。苯甲酰新乌头胺（Benzoylmesaconine, BMA）是一种单酯二萜类生物碱,是新乌头碱（Mesaconitine, MA）的水解产物,也是川乌最主要的有效成分之一。BMA具有显著的镇痛作用,已有文献证实BMA对RA具有治疗作用；且其在乌头汤提取液中的含量显著高于其他乌头类生物碱。因此,本实验选择BMA作为乌头汤“君药”的代表成分,研究其药代动力学特征。麻黄为乌头汤的“臣药”,麻黄碱是其主要有效成分。麻黄碱在乌头汤产生临床疗效的过程中发挥了重要的作用。麻黄碱具有类似于肾上腺素的化学结构,可与血管中肾上腺素受体结合。肾上腺素受体结合,产生舒张血管的作用,从而加快血流速度、增加皮肤血流量,从而辅助川乌以增强疗效。已有大量文献报道麻黄碱是麻黄含量最高的生物碱,其在乌头汤提取液中的含量也显著高于其他化学成分。因此,本实验选择麻黄碱作为乌头汤“臣药”的代表成分,研究它的药代动力学特征及肠道吸收特征。然而,关于乌头汤有效成分的药代动力学研究有以下几个难点。首先,乌头汤由多种药材组成,其成分复杂；其次,生物样品中待测物质浓度低,对其提取、分离、纯化、检测均有较高难度：第三,中药药代动力学研究的生物样本量多,工作量大。因此,建立一个灵敏、准确、快速的生物样品定量分析方法是药代动力学研究的关键。超高效液相色谱-串联质谱（Ultra Performance Liquid Chromatography tandem Mass Spectrometry, UPLC-MS/MS）充分体现了色谱和质谱优势的互补。UPLC-MS/MS具有高灵敏度和较强的专属性,不需要使分析物之间实现完全的色谱分离,使得样品预处理过程简化,且大大缩短样品的分析时间；MRM模式还允许同时对多个成分进行定性、定量分析。采用UPLC-MS/MS可更加准确、快速的分析样品,有利于获得更精确的药代动力学参数。研究目的本实验旨在对乌头汤“君药”、“臣药”代表成分的药代动力学特征进行深入研究,以期为乌头汤更深入的研究及其临床应用提供物质基础和理论依据。主要研究内容包括以下几点：1.研究口服乌头汤后BMA的药代动力学特征,考察乌头汤其他组分对“君药”代表成分的体内过程的影响作用。2.研究口服乌头汤及麻黄单味药材提取液后麻黄碱的药代动力学特征,考察乌头汤其他组分对“臣药”代表成分的体内过程的影响作用。3.采用大鼠在体肠灌流模型,研究乌头汤中麻黄碱在大鼠肠道不同部位的吸收特征,考察乌头汤其他组分对“臣药”代表成分在肠道吸收的影响作用。实验方法及结果1.“君药”代表成分苯甲酰新乌头胺药代动力学研究我们建立了一个快速、灵敏的UPLC-MS/MS方法,用于定量测定样品中BMA的含量。冷冻干燥已制备的乌头汤提取液,制成冻干粉末,于实验前日使用UPLC-MS/MS测定其中BMA的含量。选用10只体重为230～280g的雄性SD大鼠,随机分为两组,按照5mg/kg （BMA）的剂量分别灌胃给予乌头汤提取液及BMA溶液。分别于给药后5、15、30、45、60、90、120、180、240、420、600min经大鼠眼眶静脉丛采集血样约0.3ml,所采集的血样在8000rpm离心8min,取上层血清至EP管,置于-80℃冰箱中保存备测。血浆样品处理如下：取80μl血浆样品,加入320μl甲醇（睾丸酮浓度为100nM）,用于去除血浆的蛋白成分,在13000rpm离心30min,吸取适量上清液,室温下氮气吹干,所得残渣以100μl甲醇水溶液（50%）复溶,然后在13000rpm离心30min,吸取上清液进样分析。经UPLC-MS/MS测定样品中BMA的含量,并采用WinNonlin3.3软件的标准非室性模型计算BMA的药代动力学参数。大鼠口服给药BMA溶液后,BMA的血药浓度于45min达峰；600min后,血浆样品中BMA浓度接近O。然而,口服给药等剂量BMA的乌头汤提取液,BMA的血药浓度于15min达峰；240min后,血浆中的BMA基本上完全被清除。以BMA溶液为参照组,口服给药乌头汤提取液后,BMA的相对生物利用度为19.9%。口服给药乌头汤提取液后,BMA在大鼠体内的AUC较低；其Tmax及MRT均显著缩短,经两独立样本t检验（Two Independent Samples t-test）进行分析,具有显著性差异（P<0.05）。2.“臣药”代表成分麻黄碱药代动力学研究我们建立了一个快速、灵敏的UPLC-MS/MS方法,用于定量检测血浆中麻黄碱的浓度。取麻黄单味药材制备提取液,并制成冻干粉末。于实验前日使用HPLC测定乌头汤提取液和麻黄单味药材提取液冻干粉末中麻黄碱的含量。选用20只体重为230～280g的雄性SD大鼠,随机分为4组。其中三组按照10mg/kg（麻黄碱）的剂量分别灌胃给予盐酸麻黄碱溶液、麻黄单味药材提取液及乌头汤提取液,并于给药后5、15、30、45、60、90、120、180、240、420、600、1440min经大鼠眼眶静脉丛采集血样约0.3ml;另外一组按照4mg/kg：麻黄碱)的剂量静脉注射盐酸麻黄碱溶液,并于给药后1、5、12、18、30、45、72、100、150、240、480、600min经大鼠眼眶静脉丛采集血样约0.3ml。所采集血样在8000rpm离心8min,取上层血清至EP管,置于-80℃冰箱中保存。血浆样品处理如下：取80μl血浆样品,加入520μl乙酸乙酯（睾丸酮浓度为20μM）,用于去除血浆的蛋白成分,在13000rpm离心30min,吸取上清液400μl,室温下氮气吹干,所得残渣以100μl甲醇水溶液（50%）复溶,然后在13000rpm离心30min,吸取上清液进样分析。经UPLC-MS/MS测定样品中麻黄碱的含量,并采用WinNonlin3.3软件的标准非室性模型计算BMA的药代动力学参数。以10mg/kg（麻黄碱）的剂量灌胃给药盐酸麻黄碱溶液、麻黄单味药材提取液及乌头汤提取液后600min,血浆样品中麻黄碱的基本完全被清除；三组大鼠的绝对生物利用度分别为83.4%、71.4%、29.9%。以口服盐酸麻黄碱溶液为参照组,口服麻黄单味药材提取液及乌头汤提取液后,麻黄碱的相对生物利用度分别为85.6%、35.9%。口服乌头汤及麻黄单味药材提取液后,麻黄碱的Tmax显著缩短,经单因素方差分析（One Way ANOVA）进行分析,具有显著性差异（P<0.05）。3“臣药”代表成分麻黄碱肠道吸收特征研究冷冻干燥已制备的乌头汤提取液,制成冻干粉末,于实验前日使用HPLC测定其中麻黄碱的含量。精密称取适量盐酸麻黄碱及乌头汤冻干粉末,以HBSS溶液溶解稀释至麻黄碱浓度为40μg/ml。所用实验动物为230～280g的雄性SD大鼠。本实验采用大鼠在体肠灌流模型考察乌头汤中麻黄碱在肠道不同部位的吸收情况。以含有麻黄碱的HBSS溶液（盐酸麻黄碱溶液、乌头汤提取液）同时灌流大鼠的四个肠段（十二指肠、空肠上段、回肠下段、结肠）,每隔30min收集一次样品。往收集到的灌流液样品中加入乙腈（v：v=2：1）去除蛋白,样品在13000rpm离心处理30min,吸取上清液。经UPLC系统检测分析,进样体积为10μl。灌流盐酸麻黄碱溶液后,麻黄碱在十二指肠、空肠、回肠、结肠的渗透系数（Peff）分别为2.20、1.81、2.33、1.68；麻黄碱在四个肠段的吸收率依次为24.9%、19.5%、25.2%、17.0%。灌流乌头汤提取液后,麻黄碱在十二指肠、空肠、回肠、结肠的渗透系数（Peff）分别为2.33、2.31、3.35、2.68；麻黄碱在四个肠段的吸收率依次为27.7%、26.4%、37.4%、30.3%。乌头汤提取液中麻黄碱在空肠、回肠及结肠的吸收率较高,经两独立样本t检验（Two Independent Samples t-test）进行分析,具有显著性差异（P<0.05）。结论1.口服给药乌头汤后,BMA的相对生物利用度为19.9%：BMA在大鼠体内的Tmax显著缩短,表明乌头汤中存在可促进BMA吸收的成分,有利于乌头汤快速起效；BMA在大鼠体内的MRT显著缩短,表明乌头汤中存在可加速BMA清除的成分,有利于BMA的清除而避免发生蓄积。2.口服给药乌头汤后,麻黄碱的绝对生物利用度为29.9%,低于口服给药含有相同剂量的盐酸麻黄碱溶液（83.4%）及麻黄单味药材提取液（71.4%）。口服给药乌头汤及麻黄单味药材提取液后,麻黄碱的大鼠体内的Tmax显著缩短,表明乌头汤中存在可促进麻黄碱吸收的成分。3.使用乌头汤及盐酸麻黄碱溶液进行大鼠在体肠灌流,麻黄碱在大鼠全肠道吸收良好,无明显的特定吸收部位。乌头汤中的麻黄碱在大鼠空肠、回肠及结肠的吸收率显著升高,表明乌头汤中存在促进其肠道吸收的成分。