论文摘要
研究背景:血迷路屏障（blood labyrinth barrier, BLB）的存在保证了内耳微环境的相对稳定,维持正常的内耳生理功能。正常的BLB依赖于血管的稳态,是正常听力功能的基础之一。它主要由耳蜗外侧壁血管纹、螺旋韧带处连续无窗的毛细血管内皮细胞,与边缘细胞之间和基底细胞之间的致密闭锁带,以及蜗轴细胞间的连接复合体构成[1]。耳蜗外侧壁血管纹（stria vascularis,StV）是构成膜蜗管外壁的重要组成部分,内含丰富微血管。StV主要由边缘细胞（marginal cell）、中间细胞（intermediate cell）、基底细胞（basal cell）等三种细胞组成,其中毛细血管基膜菲薄,血管内皮细胞接触面近管腔侧和边缘细胞之间均为紧密连接（tight junction, TJs）,其内皮细胞周围被周细胞包绕,后者向内皮伸出纤维突起,也与之形成紧密连接。StV是耳蜗代谢最旺盛处,其主要功能是分泌K+和吸收内淋巴液电解质,并产生内淋巴正电位。内淋巴中高浓度的K+聚积及内、外淋巴液中K+循环是保持正常毛细胞功能的必要条件,也是维持耳蜗功能和内环境稳定的基础。近年来,国内外研究人员对BLB进行了大量的形态学和功能学的研究,但从分子角度对其形态学与功能学探讨及其之间作用机制的研究甚少。TJs是由多种蛋白质共同构成的结构复杂,功能多样的复合体。TJs不仅能够封闭细胞间隙,参与构成屏障系统,而且还与细胞内信号传导以及细胞的生长分化有关,并且在多种病变中都与TJs的改变有关。随着研究的深入,发现TJs还具有很多别的功能。如:TJs具有特定的阀门功能,可以调整水,分子和离子的细胞间通路;TJs阻止蛋白质和脂质在质膜顶端和底端之间的自由扩散,起到了保持细胞极性的作用[2];构成TJs的蛋白质参与细胞内的信号传导;还可以往返于细胞核与TJs之间,并且能够与特异的转录因子结合,参与基因的表达与调控等[3]。很多病理、理化因素都可以影响TJs蛋白的表达,使其发生改变。TJs蛋白主要包括跨膜蛋白occludin,claudins,JAMs,胞质附着蛋白ZO家族（zonula occludens protein）及与其相连的细胞骨架蛋白。其中以occludin与ZO-1尤为重要。跨膜蛋白occludin分子量约为60 kDa,包括两个细胞外环和四个跨膜区域,氨基端和梭基端均位于胞浆内[4],其中第一个细胞外环和梭基端在不同种属间有高度同源性[5]。Occludin直接参与TJs的构成。ZO-1分子量为220～225kDa,位于多种上皮细胞和内皮细胞间的闭锁小带中[6],在胞质内有多个结合位点。Occludin的羧基端含有一个coiled-coil结构域,该结构域是occludin与ZO-1相互作用的位点。Occludin与ZO-1相互作用后,将跨膜蛋白和细胞骨架连接在一起,并调节细胞内外信号转导途径,改变肌动蛋白收缩性,影响细胞间紧密连接装配与功能,调节其通透性[7-9]。Occludin及ZO-1的表达和分布与内皮细胞通透性密切相关。所以我们在本课题的研究中,选择以occludin,ZO-1作为研究对象,研究其在豚鼠内耳中的表达。研究目的:本实验通过免疫组织化学染色方法和Western Blot检测,观察occludin及ZO-1在耳蜗中的表达,取脑和肺组织作为阳性对照组。研究occludin及ZO-1在豚鼠耳蜗中的表达和分布情况,对于未来深入研究occludin和ZO-1等TJs蛋白在血迷路屏障分布的意义,它们如何参与调控BLB通透性,尤其是在病理条件下TJs蛋白受到破坏后BLB的病变机制,对内耳疾病药物治疗中的疗效评估及是否可以通过旁细胞路径给药[10]治疗内耳疾病等这些问题都具有重要的意义。材料和方法:1.材料健康成年杂色豚鼠40只,雌雄不限,耳廓反射灵敏,体重250～350 g,由第四军医大学实验动物中心提供。occludin及ZO-1兔抗豚鼠抗体购自美国Zymed公司。羊抗兔二抗购自美国Sigma公司。兔抗豚鼠Actin抗体购自美国Santa Cruz公司。其它试剂均为分析纯试剂。2.免疫组织化学染色动物10 g/L戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔麻醉,新鲜配置的40 g/L多聚甲醛灌注后断头,取出双耳听泡,刺开蜗尖及圆窗膜,灌注蜗尖数次,将耳蜗取出置入40 g/L多聚甲醛中,4℃中放置24 h后以100 g/LEDTA脱钙14 d,同时取脑皮质及肺组织投入40 g/L多聚甲醛中24 h后700 mL/L乙醇室温保存。石蜡包埋后沿蜗轴行平行切片,切片厚度5μm,取三种组织的三套石蜡切片分别进行anti-ZO-1,anti-occludin和阴性对照染色切片,脱蜡、水化,PBS洗后分别加入一抗,包括ZO-1兔多克隆抗体（1:100）及occludin兔多克隆抗体（1:100）,4℃过夜;PBS洗;滴加羊抗兔二抗（1:200）,37℃孵育2 h;滴加链霉素卵白素过氧化物酶（ABC）,37℃孵育1 h,PBS冲洗;DAB显色,自来水冲洗,脱水,透明,封片,在光镜下观察。阴性对照实验采用PBS代替一抗,其余步骤同上。3. Western Blot检测动物10 g/L戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔麻醉后迅速断头,取出双耳听泡,在体视显微镜下迅速取出耳蜗外侧壁血管纹及螺旋韧带,同时取出脑皮质及肺,-80℃冰箱备用。蛋白质的提取:将耳蜗,脑和肺组织分别处理,匀浆器中加入组织裂解液,包括20mmol/L Tris PH7.4,NaCl,NaF,焦磷酸钠,蔗糖,complete,Mini, EDTA-free药片（Roche Diagnostics,德国）,冰上充分匀浆,12000 g,4℃,离心5 min,收集上清。考马斯亮蓝检测三组蛋白的含量。按照每泳道5μg加载于SDS-PAGE凝胶电泳孔中,以恒压120 V/40 mA电泳至溴酚蓝到达凝胶底边。恒流300 mA转印于NC膜上。丽春红染色,TBST缓冲液配置的50 g/L的脱脂奶粉室温下封闭2 h。三组分别加入兔抗豚鼠ZO-1一抗（1μg/mL）,兔抗豚鼠occludin一抗（2μg/mL）及β-actin（1:200）,4℃过夜,TBST缓冲液洗膜2次,每次10 min,TBS缓冲液洗膜1次,10 min,加入HRP标记的二抗（1:5000）,37℃孵育1 h,洗膜3次,每次10 min。ECL化学发光系统（pierce）检测ZO-1,occludin及β-actin的蛋白表达水平。分析阳性条带的分子量大小,用TANON高清晰度计算机图象分析系统进行灰度扫描分析,根据信号的强弱分析蛋白的表达量。以目的条带与β-actin内参条带灰度的比值代表蛋白质表达水平。4.统计学处理采用SPSS13.0统计软件,数据均用x±s表示,应用One-way ANOVA方差分析法对两组以上的数据进行两两之间进行统计学检验。统计学差异设为P<0.05。结果:1. Occludin,ZO-1的免疫组化染色结果:光学显微镜下观察均可见,occludin,ZO-1在耳蜗外侧壁血管纹和螺旋韧带毛细血管内皮细胞,螺旋凸细胞,外沟细胞,血管纹边缘细胞、基底细胞及Corti器毛细胞、支持细胞深染棕黄色阳性颗粒,用PBS代替一抗时未发现免疫信号;脑组织中见沿毛细血管内皮细胞内壁一周均表现为强阳性染色,在大血管中更为明显,星型胶质细胞亦有表达;肺组织中见整张切片较强的阳性颗粒,主要表达在毛细血管内皮细胞内壁,肺泡上皮细胞。2. Occludin,ZO-1的Western Blot半定量结果:采用occludin和ZO-1的抗体可分别识别出三种组织上这两种蛋白的表达,采用β-actin作为内参,分别于220KDa、60KDa、43KDa出现阳性条带。计算机灰度扫描软件分析灰度值,统计学分析结果提示:occludin及ZO-1在耳蜗外侧壁血管纹、脑皮质及肺组织中均有表达。脑组织中occludin,ZO-1的蛋白表达量分别较耳蜗少了67.11%（ P<0.05）,46.82%（ P<0.05）。肺组织中occludin,ZO-1的蛋白表达量分别较耳蜗少了56.79%（P<0.05）,60.44%（ P<0.05）。脑组织中occludin的表达量较肺组少了31.39 %（ P<0.05）,脑组织中ZO-1的表达量较肺组织多了25.61%（ P<0.05）。结论:免疫组织化学染色后在光镜下可见TJs蛋白occludin,ZO-1在豚鼠耳蜗中主要表达在耳蜗外侧壁血管纹,螺旋韧带及Corti器等处;Western Blot检测的分析结果中发现occludin、ZO-1在豚鼠耳蜗中广泛分布及高浓度表达,且含量均高于脑组织和肺组织。这些结果均说明TJs蛋白中最具特殊性的跨膜蛋白occludin和胞质附着蛋白ZO-1在血迷路屏障的结构和功能维持中,可能与血脑屏障相似,具有更为复杂的、不可替代的作用。