论文摘要
本研究采用克隆测序技术，首次测定了中国荷斯坦奶牛干扰素-τ（bIFN-τ）成熟蛋白基因的编码区（CDS）全序列（GenBank登录号：DQ680846、DQ680847），并利用生物信息学方法对bIFN-τ的结构和功能进行了预测，结果表明：bIFN-τ成熟蛋白基因的CDS全序列长度为519bp，编码172个氨基酸的blFN-τ。对bIFN-τ成熟蛋白基因的CDS全序列和Gerd3ank上已公布的相关序列进行聚类分析，可将其聚为4类，发现了新的一类bIFN-τ（τ4）和六种新亚型（τle、τ3f、τ3g、τ3h、τ4a、τ4b）。DQ680846属于τ4类的一种亚型，标记为τ4a；DQ680847属于τ3类的一种亚型，标记为τ3f。各bIFN-τ基因核苷酸序列间的同源性在92.7％～99.8％之间，推导氨基酸序列间的同源性在88.5％～99.4％之间；τ4a、τ3f与其他bIFN-τ基因核苷酸序列间的同源性分别在94.0％～97.1％、92.9％～99.6％之间，推导氨基酸序列间的同源性分别在91.4％～96.0％、88.5％～99.4％之间。不同物种IFN-τ基因可聚为4类：普通牛与美洲野牛、水牛聚为一类；绵羊、山羊、麝香牛聚为另一类；大额牛、马鹿、麝香鹿聚为第三类：长颈鹿单独为一类。各物种IFN-τ基因核苷酸序列间的同源性在84.6％～99.2％之间，推导氨基酸序列间的同源性在68.4％～97.7％之间；中国荷斯坦奶牛bIFN-τ基因τ4a和τ3f与其他物种IFN-τ基因核苷酸序列间的同源性在87.7％～99.2％之间，推导氨基酸序列间的同源性在74.1％～97.7％之间。对bIFN-τ的结构和功能进行生物信息学预测，发现bIFN-τ氨基酸序列中有一个潜在的N-糖基化位点，Asn78可被糖基化。bIFN-τ中存在5个主要的疏水区，分别位于氨基酸序列的53～68位、75～86位、96～104位、114～121位和139～156位。bIFN-τ氨基酸序列中有6个潜在的磷酸化位点：Ser25、Ser137、Ser153、Ser155、Thr119和Tvr136。bIFN-τ的Cysl和Cys99、Cys29和Cys139各自形成两个二硫键，以维持其立体结构。bIFN-τ的三维结构是以5个α-螺旋为基础构成的，α-螺旋由111个氨基酸残基形成，占64.53％；螺旋之间为无规卷曲，由61个氨基酸残基形成，占35.47％。bIFN-τ氨基酸序列3～155位是包括IFN-α，β，ω，τ，δ等在内的Ⅰ型IFN家族的典型保守结构功能域。由此可以推测出bIFN-τ具有Ⅰ型IFN所共有的抗病毒、抗细胞增生、免疫调节等生物学功能。本研究将bIFN-τ基因定向克隆到原核表达载体pET-28a（+）中，构建了重组融合表达质粒pET-28a-bIFN-τ，转化大肠杆菌BL21（DE3），用IPTG诱导表达，优化表达条件，并初步纯化重组融合蛋白，结果表明：bIFN-τ基因在重组融合表达质粒pET-28a-bIFN-τ中的插入方向和读码框均正确；该基因已在大肠杆菌BL21（DE3）中实现了融合表达，其表达量占菌体总蛋白的20.68％。对表达条件进行了优化，其表达量可达28.84％。在37℃和30℃时进行诱导，融合蛋白的表达量高于25℃和20℃时的诱导；在诱导后1h就有融合蛋白表达，诱导后3h融合蛋白的表达量达到峰值。通过固定相金属离子亲和色谱（IMAC）方法纯化重组融合蛋白。咪唑浓度为300～500mmol／L的Elutionbuffer的纯化效果较好，纯化后的重组融合蛋白的浓度和纯度都很高。
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