公猪膻味物质粪臭素的乳酸菌降解研究

论文摘要

公猪具有饲料转化率高、胴体瘦肉率高、脂肪多不饱和脂肪酸含量高以及避免动物去势等优点。但公猪膻味是目前阻碍公猪生产的主要障碍。粪臭素（3-甲基吲哚）是引起公猪膻味的两大主要物质之一。虽已有选育低膻味的猪种、饲养管理调控粪臭素水平等方面的研究,但尚处于理论研究阶段。免疫去势又会丧失公猪的部分优良性能。因此在加工环节进行公猪膻味的控制显得十分必要。而目前这方面的研究主要限于熏制、腌制、与普通猪肉混合使用和添加香辛料对膻味进行掩盖,缺乏对粪臭素具有针对性的处理和对加工过程中粪臭素变化的研究。因此开展了对乳酸菌降解粪臭素的探索。主要开展了以下4方面的工作,并取得一定的成果：（1）粪臭素对受试乳酸菌生长的影响及4菌株降解粪臭素能力的比较。分别在MRS培养基和限制碳、氮源的调整MRS （MMRS）培养基中测定了0、0.5、2.0和5.0μg/mL四个粪臭素浓度下短乳杆菌1.12（Lactobacillus bevis, Lacl.12）、乳酸菌1.454（Lactobacilus lactis, Lac1.454）、植物乳杆菌102（Lactobacillus plantarum, Lac102）和乳链球菌6020 （Streptococcus lactis, Str6020） 72h内的生长曲线。比较了上述3个浓度水平时4株菌在MRS和MMRS两种培养基中培养192h对粪臭素的降解率。并对菌体在磷酸盐缓冲液中吸附/吸收粪臭素的能力进行了研究。结果表明：0.5-5.0μg/mL的粪臭素能导致菌株生长总量下降,5.0μg/mL时发生12h左右的迟滞,Lac1.12比其他菌株的耐受能力强。菌株对粪臭素的敏感性与粪臭素浓度和培养基的组成都有关。在两种培养基和3个粪臭素浓度下Str6020对粪臭素的降解都显著高于其他3菌株达到22.17-28.05%。培养基和粪臭素浓度对Str6020的降解率没有显著影响,但其余各菌在0.5μg/mL时的降解率（2.56-3.63%）显著低于2.0和5.0μg/mL（6.41-10.35%）。磷酸盐缓冲液中的非生长的菌体可吸收／吸附0.85-2.96%的粪臭素,培养基中减少的粪臭素仅有小部分是由于吸收／吸附。未发现菌株对粪臭素的敏感性和菌株降解能力间的相关性。（2）Str6020降解粪臭素部分Ⅰ相代谢产物的分离鉴定。发酵液经乙酸乙酯萃取,N2吹挥去有机溶剂,残留物用甲醇溶解后进行HPLC分析。HPLC分析分别采用了醋酸铵缓冲液：乙腈和磷酸盐缓冲液：乙腈两种流动相进行梯度洗脱。同时用二极管阵列紫外检测器及荧光检测器检测。通过与对照品的保留时间和紫外吸收图谱比对进行产物定性分析。并将代谢产物对照品添加到MMRS中用Str6020培养以了解对照品被菌株利用的情况。现有HPLC条件下各目标组分分离良好。共检测到4个分别与对照品保留时间相同的峰。其中与3-甲基羟基吲哚（3-methyl oxindole,3MOI）和3-甲基-3-羟基-吲哚-2-酮（3-hydroxy-3-methylo-xindole, HMOI）峰对应物质的紫外吸收特征也和相应对照品一致,而与邻氨基苯乙酮（2-aminoacetophenone,2AM）峰对应物质的紫外吸收和对照品不同,吲哚-3-甲醇（indole-3-carbinol, I3C）在阴性对照中也有检出,只是阴性对照中含量更低。Str6020可利用添加于培养基中的3MOI、HMOI、I3C和3-吲哚甲酸（indole-3-carboxylic acid, I3CA）初步判断3MOI和HMOI是Str6020代谢粪臭素的产物,2AM和I3C需进一步鉴定。未检测到3-吲哚甲酸（indole-3-carboxylic acid, I3CA）。3MOI和HMOI的存在表明Str6020降解可首先发生在2位的氧化。（3）比较粪臭素发酵前后对细胞生长、DNA损伤和细胞周期的影响。用1.1-4.4μg/mL粪臭素在发酵前后分别干预人肺扁平上皮癌细胞QG-56。用MTT比色法测定细胞的生长,用碱性彗星（单细胞凝胶电泳）实验测定细胞DNA的单链损伤,用流式细胞技术测定细胞周期分布。结果表明：发酵后对细胞生长的毒性降低,1.1和4.4μg/mL时差异显著。慧尾长、彗星长、尾部DNA%、Olive矩和彗星尾／头（长）指标均显示发酵后细胞DNA单链损伤降低,但差异未达显著水平（P<0.05）。流式细胞分析未检测到细胞凋亡和细胞周期的显著改变。可见发酵处理不会导致粪臭素在上述三方面毒性的增加。（4）粪臭素降解主要外界影响因素的筛选和模拟公猪肉中粪臭素的降解。在单因素试验的基础上通过PB实验设计方法筛选发酵温度、NaNO2浓度、NaCl浓度、培养基初始pH值和接种量5个因素中对Str6020降解粪臭素影响显著的因素。添加粪臭素到公猪肉中使粪臭素浓度达2.0μg/mL作为模拟公猪肉,以Str6020作发酵菌株生产模拟公猪肉香肠,分析发酵后肉中粪臭素含量变化。结果表明：影响排前3位的因素分别是发酵温度、NaNO2浓度、NaCl浓度,贡献值分别达65.29%、15.5%和11.06%,三者累积91.90%,对粪臭素降解影响显著。经25℃发酵144h公猪肉中的粪臭素比发酵前降低了12.65%,且降解主要是Str6020作用的结果。此文进行了乳酸菌降解培养基和猪肉中粪臭素的研究,筛选到具有较强降解能力的Str6020菌株。首次对乳酸菌体外降解粪臭素的Ⅰ相代谢产物进行了分离鉴定。共检测到4种代谢产物,其中两种为HMOI和3MOI。采用单细胞凝胶电泳技术、MTT细胞生长测定技术和流式细胞技术对粪臭素经Str6020降解前后在细胞生长、DNA单链损伤和影响细胞周期分布三方面毒性的作用进行了比较,表明粪臭素经乳酸菌降解不会导致以上方面毒性的增加。并借助PB实验设计方法筛选出发酵温度、NaNO2浓度、NaCl浓度三个影响粪臭素降解的重要因素。此研究结果为优化乳酸菌降解粪臭素的条件、阐明粪臭素降解机理以及将乳酸菌用于公猪肉中粪臭素的降解奠定了基础,为在加工环节控制膻味开辟了新的思路,并可为进一步选育降解粪臭素的乳酸菌株、甚至其他菌种,全面评估粪臭素经微生物降解后的毒性变化提供参考。

论文目录

摘要

ABSTRACT

第1章文献综述

0 前言

1 粪臭素的性质

1.1 粪臭素的性质

1.2 粪臭素的来源

1.3 粪臭素的检测

2 粪臭素与动物生产

2.1 粪臭素与反刍动物

2.2 粪臭素与人

2.3 粪臭素与微生物

2.4 粪臭素与猪

3 粪臭素的代谢产物研究进展

3.1 代谢产物的研究方法

3.2 不同生物的代谢产物

3.3 小结

4 本课题研究的目的、意义和主要研究内容

4.1 本课题的研究的目的和意义

4.2 本课题的主要研究内容

第2章不同受试乳酸菌对粪臭素的降解

0 前言

1. 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.2 实验方法

1.3 数据分析处理

2 结果与分析

2.1 试验乳酸菌的形态观察

2.2 不同试验乳酸菌的生长特性

2.3 粪臭素浓度和峰面积关系的标准曲线

2.4 MRS培养基中粪臭素的添加回收率试验结果

2.5 不同试验乳酸菌降解粪臭素的研究结果

3 讨论

3.1 粪臭素对微生物的影响

3.2 粪臭素的微生物利用

4 小结

本章参考文献

第3章 STR6020降解粪臭素部分Ⅰ相代谢产物分离鉴定

0 前言

1. 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.2 实验方法

2 结果与分析

2.1 3-甲基-3-羟基-吲哚-2-酮（HMOI）鉴定结果

2.2 醋酸铵缓冲液:乙腈梯度洗脱的分析结果

2.3 磷酸盐缓冲液:乙腈梯度洗脱的分析结果

2.4 对照品添加培养的结果

3 讨论

3.1 粪臭素Ⅰ相代谢产物分离分析方法

3.2 粪臭素Ⅰ相代谢产物定性和定量分析

3.3 粪臭素Ⅰ相代谢产物及代谢途径

4 小结

本章参考文献

第4章 STR6020降解对粪臭素细胞毒性的影响

0 前言

1. 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.2 实验方法

2 结果与分析

2.1 MTT法测定QG-56细胞活性的结果

2.2 彗星试验结果

2.3 细胞周期测定结果

3 讨论

3.1 粪臭素对细胞活性的影响

3.2 粪臭素对细胞DNA的损伤

3.3 粪臭素对细胞周期的影响

4 小结

本章参考文献

第5章 STR6020降解粪臭素的特性研究

0 前言

1. 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.2 实验方法

2 结果与分析

2.1 培养基初始pH值对菌株生长和粪臭素降解的影响

2.2 接种量对菌株生长和粪臭素降解的影响

2.3 NaCl浓度对菌株生长和粪臭素降解的影响

2浓度对菌株生长和粪臭素降解的影响'>2.4 NaNO₂浓度对菌株生长和粪臭素降解的影响

2.5 培养温度对菌株生长和粪臭素降解的影响

2.6 不同培养温度下Str6020的产酸能力

2.7 Str6020与部分发酵菌种的拮抗作用

2.8 粪臭素降解重要因素的筛选

2.9 Str6020对添加到公猪肉中粪臭素的降解

3 讨论

3.1 环境因素对菌株生长和粪臭素降解的影响

3.2 Str6020的产酸能力及影响因素

3.3 Str6020与其他部分肉品发酵菌种的拮抗作用

3.4 粪臭素降解重要影响因素的筛选

3.5 Str6020对添加到公猪肉中粪臭素的降解

4 小结

本章参考文献

第6章全文总结与展望

1 总结

2 展望

致谢

在学期间已/待发表论文及科研情况

公猪膻味物质粪臭素的乳酸菌降解研究

论文摘要

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