芽胞杆菌多铜氧化酶锰氧化机制的研究

论文摘要

锰氧化物是土壤、沉积物的重要组成成分,广泛参与土壤中物质迁移转化,是土壤生态系统演化和物质循环的重要环节。许多微生物可强烈催化可溶的Mn（Ⅱ）氧化为锰氧化物而发生沉淀,Mn（Ⅳ）的生成率比非生物催化快得多（快至105倍）。因此锰氧化细菌参与的生物氧化被认为是控制环境中锰氧化物形成的主要因素。研究土壤中细菌锰氧化的过程及氧化机制对了解土壤生态系统演化和物质循环的过程有着重要的意义。本研究选择典型、含铁锰结核和铁锰胶膜丰富的黄褐土、棕壤或者铁锰结核,从中分离出47株具有锰氧化能力的细菌（锰氧化细菌）。以从山东崅屿棕壤水沟旁表层土（结核多）中分离到的Bacillus sp.J4142,山东泰安棕壤水沟底结核中分离到的Bacillus sp.T1122,武汉黄棕壤铁锰结核中分离到的菌株Bacillus sp.WH4以及实验室保存的B.thuringiensis serovar konkukian str.97-27作为研究对象,进行生理生化特性、锰氧化过程的分子生物学机理及酶学机制等方面的研究。从不同方面对四株芽胞杆菌锰氧化机制进行探讨：1)芽胞体外锰氧化实验结果显示纯化的Bacillus sp.J4142和Bacillus sp.T1122的芽胞对Mn（Ⅱ）没有明显的氧化能力；2)Bacillus sp.J4142和Bacillus sp.T1122的发酵上清液具有锰氧化能力,且高温处理及抑制剂的处理后仍具锰氧化活性,说明发酵上清液中并不存在锰氧化酶。超滤实验发现锰氧化活性物质小于10 kDa,推测上清液的锰氧化现象可能是由于细菌生长过程中产生的胞外过氧化物造成的；3)从四株菌中成功克隆到多铜氧化酶基因,并在Escherichia coli中成功表达,纯化得到Bacillus sp.WH4中的多铜氧化酶蛋白,在体外鉴定发现具有锰氧化活性和漆酶活性。多铜氧化酶在体外具有锰氧化活性是在锰氧化研究中首次报道。4) B.thurigensis BMB171在表达Bacillus sp.WH4中的多铜氧化酶基因后,也获得了锰氧化能力,证明了Bacillus sp.WH4的锰氧化是由多铜氧化酶的催化完成的。透明颤菌中血红蛋白（VHb）是一种来源于原核生物的氧结合蛋白,研究发现它能够提高菌体获取溶解氧的能力。本研究将透明颤菌中血红蛋白基因（vgb）表达于B.thurigensis BMB171,以提高菌株的锰氧化能力,为将Bacillus sp.WH4用于地下水除锰降低生产成本提供一个新的途径。研究发现VHb在B.thurigensis BMB171中表达以后,促进了菌体生长,但是对于芽胞杆菌的锰氧化活性并没有明显的促进作用,还有待于进一步的研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 自然界中的锰分布与存在状态
• 1.2 不同形态的锰的重要作用
• 1.2.1 锰元素的生物学作用
• 1.2.2 锰地球化学作用
• 1.3 自然界中锰的微生物氧化
• 1.4 锰的微生物氧化机制
• 1.5 氧气在细菌锰氧化过程中的重要作用
• 1.6 透明颤菌血红蛋白概述
• 1.6.1 透明颤菌血红蛋白的结构和特性
• 1.6.2 透明颤菌血红蛋白的细胞定位和生物功能
• 1.6.3 透明颤菌血红蛋白的应用
• 1.7 本研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 主要仪器与试剂
• 2.2 培养基
• 2.3 锰氧化细菌的筛选和鉴定方法
• 2.3.1 锰氧化细菌的初筛
• 2.3.2 具有锰氧化活性菌株的摇瓶复筛
• 2.3.3 锰氧化细菌的鉴定
• 2.3.4 锰氧化菌氧化活性检测方法
• 2.3.5 芽胞的提取及其氧化活性检测方法
• 2.4 分子克隆方法
• 2.4.1 细菌总DNA提取
• 2.4.2 细菌质粒抽提
• 2.4.3 目的片段的PCR扩增
• 2.4.4 PCR清洁纯化以及切胶回收
• 2.4.5 酶切
• 2.4.6 连接反应
• 2.4.7 转化感受态细胞
• 2.4.8 序列测定与比对
• 2.4.9 载体构建
• 2.4.9.1 大肠杆菌表达载体的构建
• 2.4.9.2 芽胞杆菌表达载体的构建
• 2.4.9.3 基因中断载体的构建
• 2.4.10 蛋白纯化及活性检测
• 2.4.10.1 重组蛋白的表达及纯化
• 2.4.10.2 重组蛋白的锰氧化活性的检测
• 2.4.11 基因中断突变菌株的筛选
• 2.4.12 制备一氧化碳
• 2.4.13 CO差光光谱分析
• 2.4.14 限氧条件下菌体摇瓶生长与锰氧化情况考察
• 3 结果与分析
• 3.1 锰氧化细菌的分离与筛选
• 3.1.1 锰氧化细菌的分离与筛选
• 3.1.2 分离的锰氧化细菌的16SrDNA的鉴定
• 3.1.2.1 16SrDNA的PCR扩增
• 3.1.2.2 16SrDNA测序与鉴定
• 3.1.2.3 分离菌株与已知海洋锰氧化芽胞杆菌的16SrDNA系统发育树
• 3.2 锰氧化细菌芽胞对Mn（Ⅱ）的氧化
• 3.2.1 细菌芽胞的提取纯度
• 3.2.2 纯化的芽胞对Mn（Ⅱ）的氧化
• 3.3 锰氧化细菌发酵液上清对Mn（Ⅱ）的氧化
• 3.3.1 高温处理后上清液对Mn（Ⅱ）的氧化
• 3.3.2 抑制剂处理后上清液对Mn（Ⅱ）的氧化
• 3.3.3 上清液中Mn（Ⅱ）氧化因子的分子量研究
• 3.4 锰氧化细菌中多铜氧化酶基因的研究
• 3.4.1 多铜氧化酶基因的扩增
• 3.4.1.1 简并引物对多铜氧化酶基因的扩增
• 3.4.1.2 特异性引物对多铜氧化酶基因的扩增
• 3.4.2 多铜氧化酶基因的克隆表达
• 3.4.2.1 多铜氧化酶基因的表达载体构建
• 3.4.2.2 多铜氧化酶基因的表达及纯化
• 3.4.3 重组蛋白MCOW的体外活性和理化性质
• 3.4.3.1 重组蛋白MCOW的体外活性
• 3.4.3.2 重组蛋白MCOW的最适pH值和最适温度
• 3.4.3.3 金属离子对重组蛋白MCOW活性的影响
• 3.4.4 锰氧化基因在芽胞杆菌中的表达
• 3.4.4.1 pHT1K-Plip-TS的启动子修饰
• 3.4.4.2 多铜氧化酶基因的表达载体构建
• 3.4.4.3 多铜氧化酶基因的表达及重组菌锰氧化活性检测
• 3.4.5 多铜氧化酶基因的中断
• 3.4.5.1 中断载体构建
• 3.4.5.2 Bacillus sp.WH4中断菌株的构建
• 3.4.6 VHb在芽胞杆菌中的表达
• 3.4.7 VHb对芽胞杆菌生长情况的影响
• 3.4.8 VHb对芽胞杆菌中的锰氧化的影响
• 4 讨论
• 4.1 自然界中锰氧化细菌的分布
• 4.2 锰氧化活性物质
• 4.3 多铜氧化酶
• 4.4 透明颤菌血红蛋白
• 5 总结与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 致谢