建鲤Na+-K+-ATPase α1和β1基因的克隆及盐度对其表达的影响

论文摘要

Na+-K+-ATPase是由两个亚基α和β组成的异源二聚体蛋白质,具有维持硬骨鱼类渗透压平衡的功能。目前对于硬骨鱼Na+-K+-ATPase a和Na+-K+-ATPaseyβ基因的研究,多集中于广盐性鱼类及洄游鱼类,对于淡水主要养殖鱼类Na+-K+-ATPase a和β基因克隆和组织表达相关方面的研究却很少。本文首次克隆了建鲤（（?）Cyprinus carpio var.jian）的Na+-K+-ATPase α1两个亚型（α1、α1.3）和β1基因全长cDNA并采用实时定量PCR技术研究了三个基因在建鲤不同组织中的表达状况及盐度变化对其表达量的影响,以期为研究建鲤渗透调节机制奠定分子基础,为扩大建鲤在盐碱地、沿海滩涂及咸淡水中的养殖提供科学依据。本实验获得的建鲤Na+-K+-ATPase α1基因cDNA全长3397bp,编码1026个氨基酸：Na+-K+-ATPase α1.3cDNA全长3265bp,编码1024个氨基酸；建鲤Na+-K+-ATPase β1cDNA全长2198bp,编码302个氨基酸。对推测的建鲤三个基因的氨基酸序列进行同源性比较和系统分析显示：建鲤Na+-K+-ATPase α1与其它鱼类该基因的氨基酸序列相似度为90.22%-95.52%,其中与斑马鱼（?）Danio rerio)相似度最高（95.52%）,与虱目鱼（Chanos chanos）（?）目似度稍低,其次是平鲷（Rhabdosargus sarba）、萨罗罗非鱼（Sarotherodon melanotheron）、底鳉（Fundulus heteroclitus）、黑鲷（Acanthopagrus schlegelii）、马苏大马哈鱼（Oncorhynchus masou）和虹鳟（Oncorhynchus mykiss）,与大西洋鲑（Salmo salar）的相似度最低（90.22%）,与非洲爪蟾（?）Xenopus laevis)和人（Homo sapiens）的相似度分别为89.62%和89.51%；建鲤Na+-K+-ATPase α1.3与其他物种的Na+-K+-ATPase α1的氨基酸序列相似度在81.45%-89.06%之间；建鲤Na+-K+-ATPaseβ1与其它鱼类Na+-K+-ATPase β1的氨基酸序列相似度在63.74%-76.08%之间,其中与斑马鱼相似度最高达76.08%,与平鲷、马苏大马哈鱼的相似度次之,在鱼类中与尼罗罗非鱼（Oreochromis mossambicus）的相似度最低,为63.74%；与非洲爪蟾的相似度为59.2%,低于与人的相似度61.2%。采用实时定量PCR技术检测Na+-K+-ATPase a1、α1.3、β1基因在建鲤鳃、肠、肝、肾、脑、脾和心脏中的相对表达量,结果显示,三个基因在鳃、肠、肝、’肾、脑、脾、心脏内都表达。Na+-K+-ATPase α1在上述组织中的表达水平依次为肠>鳃>脑>肝脏>心脏>肾>脾；Na+-K+-ATPase α1.3的表达水平依次为鳃>心脏>肾>肠>脑>肝脏>脾；Na+-K+-ATPasey β1的表达水平依次为脾>肝脏>肠>鳃>心脏>肾>脑,且Na+-K+-ATPaseα1在七个组织中的表达量均远远高于Na+-K+-ATPase α1.3.检测不同盐度下建鲤鳃内Na+-K+-ATPase al和卢1基因表达量在不同时间段内的变化情况,结果表明水体盐度变化时,建鲤为了适应外界环境,会对其Na+-K+-ATPaseαl1和β1基因的表达进行一定程度的调节,Na+-K+-ATPase al基因表达量的变化分为三个阶段,一是应激反应阶段；二是主动调节阶段；三是适应阶段。建鲤Na+-K+-ATPaseβ1基因表达量的变化与Na+-K+-ATPase al不同,推测可能与两个亚基所承担的不同功能有关。本文的结果表明,在建鲤体内存在着α1、β1多种同工型亚型,与α1、β1基因相比,α1.3基因的表达具有组织特异性,且不同的盐度对基因表达量的高低具有一定程度的影响,这为从分子水平上阐明建鲤渗透调节的机制奠定了一定的基础,此外,5‰和10%o盐度饲养的建鲤并未出现死亡,表明在盐度较低的咸水中建鲤可以生长,这为扩大建鲤在盐碱地、沿海滩涂及咸淡水中的养殖提供了科学依据。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• +-K⁺-ATPase的研究进展'>1 Na⁺-K⁺-ATPase的研究进展
• +-K⁺-ATPase的发现及亚基组成'>1.1 Na⁺-K⁺-ATPase的发现及亚基组成
• +-K⁺-ATPase的催化机理'>1.2 Na⁺-K⁺-ATPase的催化机理
• +-K⁺-ATPase活性的水环境因素'>1.3 影响Na⁺-K⁺-ATPase活性的水环境因素
• +-K⁺-ATPase在鱼类渗透调节过程中的研究进展'>1.4 Na⁺-K⁺-ATPase在鱼类渗透调节过程中的研究进展
• 1.4.1 酶活性的变化对鱼类渗透压的调节
• 1.4.2 酶两个亚基mRNA表达量的变化对鱼类渗透压的调节
• 2 盐度因子对水产养殖动物生长发育的影响
• 2.1 盐度对水产养殖动物胚胎发育和幼苗生长的影响
• 2.2 盐度对水产动物生产性能的影响
• 2.2.1 盐度对水产动物精子活力的影响
• 2.2.2 盐度对水产动物耗氧率和排氨率的影响
• 2.2.3 盐度对水产动物能量代谢的影响
• 2.3 盐度对水产动物体内酶的影响
• 2.4 盐度对水产动物组织结构的影响
• 3 本研究的意义
• +-K⁺-ATPase α1和Na⁺-K⁺-ATPase β1基因克隆及序列分析'>第二章 建鲤Na⁺-K⁺-ATPase α1和Na⁺-K⁺-ATPase β1基因克隆及序列分析
• 1 实验材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 实验仪器
• 1.3 实验试剂
• 2 实验方法
• 2.1 总mRNA的提取
• 2.2 cDNA模板的制备
• +-K⁺-ATPase α1和Na⁺-K⁺-ATPase β1引物的设计'>2.3 Na⁺-K⁺-ATPase α1和Na⁺-K⁺-ATPase β1引物的设计
• +-K⁺-ATPase α1引物设计'>2.3.1 Na⁺-K⁺-ATPase α1引物设计
• +-K⁺-ATPase β1引物设计'>2.3.2 Na⁺-K⁺-ATPase β1引物设计
• +-K⁺-ATPase α1和Na⁺-K⁺-ATPase β1中间片段的扩增'>2.4 Na⁺-K⁺-ATPase α1和Na⁺-K⁺-ATPase β1中间片段的扩增
• +-K⁺-ATPase α1和Na⁺-K⁺-ATPase β1末端（RACE）扩增'>2.5 Na⁺-K⁺-ATPase α1和Na⁺-K⁺-ATPase β1末端（RACE）扩增
• 2.5.1 5'RACE反应体系
• 2.5.2 3'RACE反应体系
• +-K⁺-ATPase α1和Na⁺-K⁺-ATPase β1末端PCR反应参数'>2.5.3 Na⁺-K⁺-ATPase α1和Na⁺-K⁺-ATPase β1末端PCR反应参数
• 2.6 扩增产物的纯化、克隆和测序
• 2.7 序列和结果分析
• 3 实验结果
• +-K⁺-ATPase α1序列分析'>3.1 Na⁺-K⁺-ATPase α1序列分析
• 3.1.1 碱基序列和氨基酸组成及特征位点分析
• +-K⁺-ATPase α1预测的蛋白质特征分析'>3.1.2 Na⁺-K⁺-ATPase α1预测的蛋白质特征分析
• +-K⁺-ATPase α1序列系统进化分析'>3.1.3 Na⁺-K⁺-ATPase α1序列系统进化分析
• +-K⁺-ATPase α1.3序列分析'>3.2 Na⁺-K⁺-ATPase α1.3序列分析
• 3.2.1 碱基序列和氨基酸组成及特征位点分析
• +-K⁺-ATPase α1.3预测的蛋白质特征分析'>3.2.2 Na⁺-K⁺-ATPase α1.3预测的蛋白质特征分析
• +-K⁺-ATPase α1.3序列系统进化分析'>3.2.3 Na⁺-K⁺-ATPase α1.3序列系统进化分析
• +-K⁺-ATPase β1序列分析'>3.3 Na⁺-K⁺-ATPase β1序列分析
• 3.3.1 碱基序列和氨基酸组成及特征位点分析
• +-K⁺-ATPase β1预测的蛋白质特征分析'>3.3.2 Na⁺-K⁺-ATPase β1预测的蛋白质特征分析
• +-K⁺-ATPase β1序列系统进化分析'>3.3.3 Na⁺-K⁺-ATPase β1序列系统进化分析
• 4 分析与讨论
• +-K⁺-ATPase α1和β1基因的组织表达及盐度对其表达的影响'>第三章 建鲤Na⁺-K⁺-ATPase α1和β1基因的组织表达及盐度对其表达的影响
• 1 实验材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 实验仪器
• 1.3 实验试剂
• 2 实验方法
• 2.1 总mRNA的提取
• 2.2 引物设计
• 2.3 盐度实验
• 2.3.1 预实验
• 2.3.2 盐度实验
• 2.4 组织表达量的测定
• 2.5 标准曲线和溶解曲线
• 2.6 数据处理
• 3 实验结果
• +-K⁺-ATPase α1、α1.3和β1在建鲤不同组织中的相对表达量'>3.1 Na⁺-K⁺-ATPase α1、α1.3和β1在建鲤不同组织中的相对表达量
• +-K⁺-ATPase α1和β1基因表达的研究'>3.2 盐度对建鲤鳃内Na⁺-K⁺-ATPase α1和β1基因表达的研究
• 4 分析与讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 科研情况