13个稻瘟菌基因的表达谱分析及受稻瘟病诱导的水稻转录因子OsBTB基因的生物学功能初探

论文题目: 13个稻瘟菌基因的表达谱分析及受稻瘟病诱导的水稻转录因子OsBTB基因的生物学功能初探

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物病理学

作者: 姜玉新

导师: 李德葆

关键词: 水稻,稻瘟菌,生物信息学,非亲和,亲和互作,近等基因系,多克隆抗体,杂交,干涉,胶体金免疫标记

文献来源: 浙江大学

发表年度: 2005

论文摘要: 在前期工作中,对受稻瘟菌生理小种103（PO6-6）侵染2、4、8h的抗性水稻品系C101A51（携带Pi2）叶片mRNA构建的cDNA文库进行EST测序,共获得了12,270条高质量的ESTs并产生5,741条独立基因。应用BLASTn程序将这些序列分别与水稻和稻瘟菌基因组序列进行搜索(E-value≤e-15),结果有36TUTs与稻瘟菌基因组匹配,其中有13条独立基因仅与稻瘟菌基因组同源。利用本实验室保存的受稻瘟菌侵染的水稻叶片cDNA文库中2,171个独立EST克隆制备完成的cDNA阵列,以稻瘟菌侵染8h的水稻近等基因系H7R/H7S的叶片总RNA为探针,通过芯片杂交、信号提取以及数据分析后,得到一批功能未知的基因。对未知基因通过生物信息学分析发现一个编码含有BTB结构域的蛋白的基因（克隆号为J001E09）并命名为OsBTB。为了确证这13个推测的稻瘟菌基因的生物信息学结果和其在稻瘟菌致病性中可能的生物学功能;通过设计特异引物并测序获得了OsBTB基因的全长cDNA。 分别提取稻瘟菌生理小种Y34和粳稻秀水11基因组,运用Southern blot杂交后,结果表明这13个基因确实来源于稻瘟菌,生物信息学分析表明,除2个未知基因外,有2个分别编码环孢菌素（Cyclophilin）和P型ATP酶的基因（GenBank受理号BI808723和BQ907640）与稻瘟病菌侵染早期附着孢形成相关;C-4甲基固醇氧化酶和δ-固醇C-甲基转移酶（BI813122和BQ907428）参与稻瘟病菌致病性相关的膜蛋白——麦角固醇的合成;还有可能与稻瘟病菌侵染过程中信号传导相关的质膜钠离子应答蛋白（BI812033）;与蛋白合成相关的核糖体L12蛋白（BM420098）和延伸因子2（BQ907452）;与真核细胞细胞体内的蛋白质的运输和分泌相关的外被体蛋白（BI813165）;参与脂肪酸生物合成的烯酰还原酶（BQ907177）等。一个编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因（BQ908235）参与了稻瘟菌孢子的产生;从受稻瘟病菌诱导水稻叶组织中筛选到的这些基因可能在病原与寄主的相互作用中起重要作用。Northern blot结果表明,这些基因在稻瘟菌的附着胞阶段都有不同程度的表达。除了环孢菌素基因在菌丝体阶段有表达外,其它基因在该阶段均未检测到。其中,质膜钠离子反应2基因（BI812033）和Nebula相关蛋白（BM419917）仅在幼附着胞阶段表达;而参与麦角固醇的2个基因的表达模式相类似;丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因在附着胞的发育过程中其表达呈递减趋势。这些结果不仅反映了它们可能的生物学功能,同时也从一个侧面反映了它们是高丰度基因。 根据生物信息学获得的OsBTB基因全长序列设计基因特异性引物,从水稻cDNA文库J001E09克隆中通过PCR扩增到基因的全长序列,测序确证了该基因的全长为1,975bp的cDNA序列,其中

论文目录:

摘要

Abstract

第一章：文献综述及研究背景

1.1 植物转录因子

1.1.1 转录因子的结构

1.1.1.1 DNA结合区

1.1.1.2 转录调控区

1.1.1.3 核定位信号区

1.1.1.4 寡聚化位点

1.1.2 顺式作用元件

1.1.3 植物转录因子的活性调节

1.1.4 转录因子的种类及功能

1.1.4.1 bZIP家族转录因子

1.1.4.2 AP2/EPEBP家族

1.1.4.3 WRKY家族

1.1.4.4 MYB转录因子

1.1.4.4.1 植物中只含一个MYB结构域的MYB蛋白

1.1.4.4.2 植物中R2R3亚类MYB成员

1.1.4.4.3 植物中R1R2R3亚类MYB成员

1.1.4.4.4 MYB类转录因子的生物学功能

1.1.4.4.5 植物体内MYB基因活性的调节

1.1.4.5 HD-Zip转录因子

1.1.4.6 MADS转录因子

1.2.BTB结构域及其蛋白家族的结构和功能

1.2.1 BTB结构域的基本结构

1.2.2 BTB结构域蛋白家族的结构

1.2.2.1 BTB-ZF蛋白

1.2.2.2 BBK蛋白家族

1.2.2.3 BTB-NPH3家族

1.2.2.4 MATH-BTB蛋白

1.2.2.5 BTB-bZip蛋白

1.2.2.6 RhoBTB蛋白

1.2.2.7 BTB-BACK-PHR(BBP)蛋白

1.2.2.8 BTB-ankyrin蛋白

1.2.2.9 K+通道四聚化作用(T1)结构域蛋白家族

1.2.2.10 没有其它被鉴定结构域的BTB蛋白

1.2.3 BTB结构域蛋白的分布

1.2.4 BTB结构域蛋白的功能

1.2.4.1 动物中BTB结构域蛋白的功能

1.2.4.2 植物中BTB结构域蛋白的功能

1.2.5 本研究的目的意义和主要研究内容

1.2.5.1 选题依据及研究的目的和意义

1.2.5.2 主要研究内容

第二章：来自受稻瘟病菌侵染的水稻cDNA文库的13个稻瘟菌基因验证及表达分析

2.1 材料和方法

2.1.1 材料

2.1.2 试剂

2.1.2.1 基因组提取所需试剂

2.1.2.2 RNA的提取所需试剂

2.1.2.3 探针标记所需试剂

2.1.2.4 杂交所需试剂

2.1.3 方法

2.1.3.1 基因组DNA的提取

2.1.3.2 DNA酶切

2.1.3.3 菌株和培养方法

2.1.3.4 RNA的提取

2.1.3.5 探针的标记

2.1.3.6 Southern杂交

2.1.3.7 Northern杂交

2.1.3.8 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶保守结构域同源性分析

2.2 结果与分析

2.2.1 稻瘟病菌和水稻基因组DNA提取及酶切结果

2.2.2 稻瘟病菌13个TUTS的Southern结果

2.2.3 稻瘟病菌13个TUTs的Northern结果

2.2.4 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶同源性分析

2.3 讨论

第三章：OsBTB基因的克隆及功能分析

3.1.材料和方法

3.1.1 OsBTB基因的克隆及其生物信息学分析

3.1.1.1 OsBTB蛋白二级结构分析

3.1.1.2 OsBTB蛋白二级结构分析

3.1.1.3 OsBTB蛋白的跨膜结构分析

3.1.1.4 OsBTB蛋白的定位分析

3.1.1.5 OsBTB蛋白的同源性搜索

3.1.2 OsBTB基因的染色体定位

3.1.2.1 水稻材料

3.1.2.2 RFLP定位

3.1.3 OsBTB基因多克隆抗体的制备及其应用

3.1.4 OsBTB蛋白的胶体金免疫标记

3.1.5 OsBTB基因在受稻瘟病菌侵染的水稻近等基因系H7R/HTS的定量PCR分析

3.1.6 OsBTB基因RNA干涉载体构建及水稻转化研究

3.2 结果与分析

3.2.1 OsBTB基因的克隆及其生物信息学分析

3.2.1.1 OsBTB基因的克隆和序列分析

3.2.1.2 OsBTB蛋白二级结构分析

3.2.1.3 OsBTB蛋白跨膜结构分析

3.2.1.4 OsBTB蛋白的定位分析

3.2.1.5 OsBTB蛋白的同源性搜索

3.2.1.6 OsBTB蛋白的三级结构分析

3.2.2 OsBTB基因的染色体定位

3.2.3 OsBTB蛋白的纯化及多克隆抗体的制备及应用

3.2.3.1 OsBTB基因原核表达载体的鉴定

3.2.3.2 OsBTB融合蛋白的获得

3.2.3.3 OsBTB蛋白的纯化及复性

3.2.3.4 兔抗OsBTB多克隆抗体的效价测定

3.2.3.5 多克隆抗体的鉴定

3.2.3.6 水稻中非亲和/亲和互作中目的基因在蛋白质水平表达

3.2.4 胶体金免疫标记OsBTB蛋白在水稻细胞中亚细胞定位

3.2.5 定量PCR分析OsBTB基因在近等基因系H7R/H7S中的表达

3.2.6 OsBTB基因RNA干涉载体的构建及水稻转化

3.2.6.1 OsBTB植物表达载体的鉴定

3.2.6.2 水稻胚性愈伤的培养

3.2.6.3 转基因植株的获得

3.2.6.4 TO代转基因植株PCR鉴定

3.3 讨论

3.3.1 OsBTB基因的生物信息学分析

3.3.2 Western blot检测OsBTB蛋白在非亲和/亲和互作中的表达

3.3.3 免疫金标记检测OsBTB蛋白的亚细胞定位

3.3.4 OsBTB基因在近等基因系H7R/H7S中表达谱

3.3.5 OsBTB基因RNA干涉载体构建及水稻转化研究

参考文献

附录A

附录B

致谢

发布时间: 2006-07-24

参考文献

• [1].几类新型稻瘟菌抑制剂的设计、合成及其生物活性研究[D]. 陈海峰.华中师范大学2016
• [2].一、稻瘟菌效应子AvrPi9在水稻中互作蛋白的筛选与功能研究 二、组蛋白去乙酰化酶HDT701与Rpp30互作调控水稻免疫反应[D]. 熊叶辉.中国农业科学院2016
• [3].稻瘟菌干扰水稻钾离子通道抑制免疫反应的分子机理研究[D]. 史学涛.中国农业科学院2018
• [4].杀稻瘟菌素的异源表达及其基因簇内关键基因的体内功能研究[D]. 吴俊.上海交通大学2012
• [5].稻瘟菌诱导性水稻OsFd和OsFNR基因的cDNA克隆与诱导表达[D]. 耿丽华.山东农业大学2004
• [6].稻瘟菌激活蛋白基因克隆及功能解析[D]. 徐锋.中国农业科学院2006
• [7].水稻与稻瘟菌互作多基因遗传基础的研究[D]. 郑燕.浙江大学2008
• [8].稻瘟菌对三唑类杀菌剂丙环唑敏感性检测及农杆菌介导的稻瘟菌转化—致病缺陷突变体筛选[D]. 方敏彦.甘肃农业大学2009
• [9].稻瘟菌蛋白激发子MoHrip2结构与功能及互作蛋白研究[D]. 刘孟洁.中国农业科学院2016
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• [9].水稻抗稻瘟病种质资源筛选评价及改造利用[D]. 黄富.四川农业大学2006
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