Nisin抗性乳酸菌的筛选及Nisin启动子的克隆

论文摘要

乳酸菌是应用最为广泛的食品级益生菌。虽然我国的乳酸菌资源十分丰富，但对其研究还处于初级阶段。这也正是给予我们食品工作者的机遇和挑战，大力推进关于乳酸菌的基础研究和开发应用，利用当今先进的生物技术（如蛋白质工程、基因工程、细胞工程等）开发新的优良工程菌株，必将从根本上改变我国传统的乳酸菌利用方式。增进乳酸菌益生作用的途径之一是使其表达一些同源或异源的目的蛋白，这就需要可靠的表达系统的协助。在这方面，国际上广泛使用的是采用Nisin启动子的NICE（Nisin-Controlled gene Expression）表达系统。启动子作为控制基因转录起始的第一个必要元件，在表达系统中占有头等重要的地位。推进启动子的相关研究，不仅为以后表达系统的构建奠定基础，还将使我们更进一步地理解原核生物基因表达调控的过程。本课题首先通过基本的形态学观察，从传统乳制品中分离乳酸菌；之后采用两倍稀释法从分离得到的乳酸菌中筛选对Nisin具有一定抗性的菌株，然后利用16S rRNA基因同源性分析对部分菌株进行鉴定。以黄色微球菌为指示菌，研究抗性菌株是否产生抑菌物质。对抑菌物质的理化性质（对热、pH和酶处理的稳定性）与Nisin的理化性质进行对比研究。综合对比研究和菌株的鉴定结果，确定Nisin产生菌。应用PCR方法，从Nisin产生菌中克隆nisA启动子片段，之后将该片段插入到启动子探针型载体pNZ273中，通过组织化学的方法检测β-葡糖苷酸酶活性，对克隆的片段进行功能验证。结果如下：本课题共分离出90株形态学观察为乳酸菌的菌株，其中50株为球菌。采用MRS固体培养基，当Nisin的添加量为0.0003 g·mL-1时，50株球菌中有15株能正常生长。用两倍稀释法对这些菌株的Nisin抗性进行的检测表明，大部分菌株对Nisin的抗性不超过0.00125 g·mL-1。15株能在Nisin环境中正常生长的菌中有4株能产生抑菌物质，并且其中S7菌株产生的抑菌物质在高温处理（121℃，15 min）时具有良好的稳定性；酸性条件（pH=2）下，抑菌物质的稳定性要好于中性条件（pH=7）下；抑菌物质能被α-胰凝乳蛋白酶降解。这些性质与Nisin的理化性质一致。采用16S rRNA序列同源性分析将S7菌株进行了鉴定，鉴定结果为乳酸乳球菌。用PCR方法从S7菌株中克隆nisA启动子，获得了大小为214 bp的片段。测序结果表明该片段与已经公布的Nisin启动子序列具有一致性。将获得的序列连入启动子探针型载体pNZ273中，构建了重组质粒pDU273。将pDU273转化L．lactis NZ9000之后，用20 ng·mL-1的Nisin诱导时，gusA基因获得了表达。本课题主要得出以下结论：采用两倍稀释法，通过逐步提高环境中Nisin的含量来筛选Nisin抗性菌株的方法切实可行。16S rRNA序列用于细菌鉴定已经成为一项常规的实验技术，随着GenBank中16S rRNA序列数据的爆炸式增长，这一技术对细菌的鉴定更加具有快速准确的特点。本课题中克隆获得的启动子片段能够启动启动子探针型载体pNZ273下游报告基因gusA的表达，证明克隆片段具有诱导型启动子的作用，可以作为nisA启动子使用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 课题背景与文献综述
• 1.1.1 抗微生物物质的产生作为一个益生功能
• 1.1.2 细菌素分类
• 1.1.3 Nisin以及Nisin合成的调控
• 1.1.4 Nisin控制的基因表达系统
• 1.1.5 NICE系统用于基因表达的优点
• 1.2 本课题研究的目的意义及内容
• 1.2.1 研究的目的意义
• 1.2.2 研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 材料与设备
• 2.1.1 质粒、菌株和引物
• 2.1.2 试剂、工具酶和试剂盒
• 2.1.3 主要溶剂和培养基的配制
• 2.1.4 仪器与设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 乳酸球菌的分离、筛选及保藏
• 2.2.2 Nisin产生菌株的筛选与鉴定
• 2.2.3 乳球菌总DNA的提取
• 2.2.4 nisA启动子序列的克隆
• 2.2.5 克隆序列的鉴定
• 2.2.6 pDU273质粒的构建
• 2.2.7 大肠杆菌和乳球菌的转化
• 2.2.8 GUS活性的检测
• 3 结果
• 3.1 乳酸球菌的分离、筛选及保藏
• 3.2 Nisin抗性菌株的筛选
• 3.3 Nisin产生菌株的筛选
• 3.4 菌株的鉴定
• 3.4.1 16S rRNA基因的扩增,克隆以及鉴定
• 3.4.2 16S rRNA基因序列的同源性分析
• 3.5 nisA启动子序列的克隆
• 3.5.1 梯度PCR
• 3.5.2 克隆片段的测序
• 3.6 pDU273质粒的构建
• 3.6.1 克隆片段与质粒pNZ273的连接
• 3.6.2 质粒pDU273的测序
• 3.7 重组质粒pDU273电转化L.lactis NZ9000
• 3.8 GUS活性的检测
• 4 讨论
• 4.1 乳酸球菌的分离、筛选及保藏
• 4.2 Nisin抗性菌株的筛选
• 4.3 Nisin产生菌株的筛选
• 4.4 菌株的鉴定
• 4.5 nisA启动子序列的克隆
• 4.5.1 梯度PCR
• 4.5.2 克隆片段的测序
• 4.6 pDU273质粒的构建
• 4.6.1 克隆片段与质粒pNZ273的连接
• 4.6.2 质粒pDU273的测序
• 4.7 重组质粒pDU273电转化L.lactis NZ9000
• 4.8 GUS活性的检测
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文