天然抗癌药物诱导肿瘤细胞凋亡及细胞表面受体识别的可视化研究

论文摘要

本学位论文主要分为两大部分:（1）利用多种荧光技术在活细胞中实时研究紫杉醇（taxol）、消癌平（Xiaoaiping）及蟾酥（Chan-Su,CS或bufonis venenum）3种天然抗癌药物抑制肿瘤细胞活性的分子机理;（2）应用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）和原子力显微镜（AFM）对细胞表面受体识别进行可视化研究。本文第一部分采用基因质粒转染技术、荧光发射谱检测分析以及FRET及其受体光漂白等技术在活细胞中实时检测紫杉醇、消癌平及蟾酥3种天然抗癌药物诱导人类肺腺癌（ASTC-a-1）细胞凋亡过程中caspase-3的活化特性。主要研究结果如下:（1）紫杉醇可以显著抑制ASTC-a-1细胞活性并诱导了细胞的肿胀及细胞质的空泡化,而且还发现紫杉醇诱导的细胞肿胀和细胞死亡不依赖于caspases的活化,表明紫杉醇可以通过类似paraptosis的方式明显诱导细胞程序性死亡。（2）消癌平可以有效抑制人肺腺癌（ASTC-a-1）细胞的增殖活性并诱导细胞的死亡。消癌平对细胞的抑制作用具有剂量依赖性;消癌平处理细胞72小时后,细胞内大量的SCAT3被切割,表明细胞内caspase-3的活化水平明显升高;消癌平作用细胞24小时内没有显著激活细胞内的caspase-3。（3）蟾酥可以有效抑制ASTC-a-1细胞的增殖活性并诱导细胞的死亡:蟾酥作用细胞能明显切割细胞内的SCAT3,细胞内的SCAT3的切割程度随着蟾酥作用时间的延长而增加,受体光漂白实验也证实了该结论,表明caspase-3参与调控了蟾酥诱导的细胞凋亡过程。本文第二部分实验发展了一种方法即采用WGA-QD结合物同时作为荧光探针及AFM形状探针（WGA-QD探针）标记细胞膜表面特异性WGA受体分子,应用LSCM和AFM对细胞表面特异性WGA受体识别进行可视化研究。这一方法具有两大优势:（1） WGA-QD探针具有发光强度大,荧光寿命长,光稳定性好的特点适用于被标记细胞、细胞表面膜结构的荧光显微镜探测及LSCM的实时探测;（2）通过免疫细胞化学反应标记到WGA受体分子上的WGA-QD探针,尺寸相对较大,能提高WGA受体分子与细胞膜其它蛋白分子的对比度,易于在AFM下分别出来。该策略更适用于AFM和LSCM的整合系统。本文采用AFM及LSCM对红细胞及人类乳腺癌细胞（MCF-7）细胞膜表面WGA受体分子的分布情况进行对比研究及分析,主要研究结果如下:（1）采用WGA-QD结合物作为AFM的形貌探针“看到”不同种类细胞膜表面WGA的结合位点,发现WGA受体分子在红细胞表面主要分布在红细胞外周突起的圈上及突起的圈与凹陷区相连接的区域,中心凹陷区域很少。WGA受体分子在MCF—7细胞表面呈疏散式分布,在某些区域分布密,在另外一些区域稀,密集区主要在中心与外周之间;（2）通过应用WGA-QD探针,本文发展了一种快速间接检测凝集素引起的整个细胞膜硬度变化的方法:利用AFM分析软件对WGA-QD探针标记的大量细胞进行单个细胞形貌图测量,迅速得出间接反映整个细胞膜硬度变化的相关参数,该研究方法很可能成为检测临床诊断指标变化的有力工具。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 第一节 荧光探测技术
• 1.1 激光扫描共聚焦显微镜
• 1.2 荧光共振能量转移（FRET）
• 第二节 纳米探测技术
• 2.1 原子力显微镜
• 2.2 扫描近场光学显微镜
• 第三节 细胞凋亡
• 3.1 前言
• 3.2 凋亡的信号途径
• 3.3 线粒体与细胞凋亡
• 3.4 线粒体通透性转变孔——细胞的生死开关
• 3.5 细胞色素c——凋亡起始因子
• 3.6 Bcl-2家族在调控细胞凋亡中的作用
• 3.7 Caspases与细胞凋亡
• 3.8 死亡受体介导的凋亡途径（或者成为外源性途径）
• 3.9 14-3-3蛋白
• 第四节 本论文拟开展的研究工作
• 参考文献（第一章）
• 第二章 天然抗癌药物诱导癌细胞凋亡的可视化研究
• 第一节 紫杉醇诱导不依赖于caspase-3程序性细胞死亡（PCD）的荧光光谱分析及AFM观察
• 1.1 前言
• 1.2 材料和方法
• 1.3 结果与讨论
• 1.4 结论
• 第二节 消癌平诱导人肺腺癌（ASTC-a-1）细胞内caspase-3活化的荧光光谱分析
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.4 结论
• 第三节 Caspase-3参与调控蟾酥诱导人肺腺癌（ASTC-a-1）细胞的凋亡
• 3.1 前言
• 3.2 材料和方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 本章小结
• 参考文献（第二章）
• 第三章 细胞表面受体识别的可视化研究
• 第一节 背景介绍
• 1.1 量子点（QDs）
• 1.2 麦芽凝集素
• 第二节 细胞表面凝集素受体的原位探测
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2.5 QDs成为建立LSCM和AFM（或NSOM）系统研究平台的桥梁
• 本章小结
• 参考文献（第三章）
• 第五章 全文总结
• 附录1 英文缩略语表
• 附录2 攻读博士学位期间参加科研工作情况
• 致谢