SRAP标记在DUS测试中的应用与高分辨率双向电泳体系的建立

论文摘要

SRAP标记具有操作简便快速、成本低、可信度高、易于测序等特点,已在马铃薯、水稻、苹果、油菜等多种植物得到了广泛的应用。本研究通过对影响SRAP标记PCR结果的因素,包括Mg2+、dNTPs、引物、Tag酶的浓度以及退火温度等的优化,建立了莴苣属蔬菜的SRAP-PCR反应体系:即在20μl反应体系中,模板DNA为50ng;Mg2+浓度为2.0mM;dNTPs浓度为0.2mM;引物浓度为0.75uM,Tag酶用量为1U。适宜的扩增程序为先94℃预变性5min,接着的5个循环按94℃变性1min、35℃复性1min、72℃延伸1min的程序进行;之后的30个循环将复性温度提高到51℃,其他的条件保持不变,最后72℃延伸7min。采用18对SRAP标记和40个用于DUS（特异性、一致性和稳定性）测试的形态学标记对50份莴苣材料进行遗传多样性分析,其中SRAP引物在不同品种间的多态信息含量（PIC）在0.39～0.97之间,平均值为0.80。使用UPGMA算法对所有材料进行聚类分析,SRAP分子标记聚类和形态学聚类都将所有材料划分成三类,对两种标记所得的结果进行相关性分析得出两者的相关系数为0.5455,表明两种结果具有较好的相关性和符合度。采用21对SRAP标记和54个用于DUS测试的形态学标记对28个不同的西瓜品种进行遗传多样性分析,其中SRAP引物在不同品种间的多态信息含量（PIC）在0.525～0.892之间,平均值为0.720,各材料间相似系数在0.92至0.99之间,而形态学标记计算结果为0.50到0.85之间。采用UPGMA法对所有材料进行聚类分析,SRAP标记聚类将所有材料划分成四类,形态学标记划分为五类,两种标记的相关系数为0.218,相关性不是很高,但在品种鉴定和区别上SRAP标记表现出一定的优越性,可以作为西瓜DUS测试的一种很好的补充。采用IPG-DALT-six系统,借鉴水稻、拟南芥等模式植物的2-DE技术并加以改进,建立了适合生菜叶片的2-DE分离分析体系,并初步分析了生菜叶片蛋白的等电点、分子量以及相对含量的分布情况,为进一步研究生菜蛋白质组提供了技术基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1.1 SRAP标记技术及其在蔬菜作物研究中的应用
• 1.1.1 SRAP标记技术
• 1.1.1.1 SRAP标记技术的原理
• 1.1.1.2 SRAP标记引物的设计
• 1.1.1.3 SRAP标记技术的特点
• 1.1.2 SRAP标记在蔬菜作物研究中的应用
• 1.1.2.1 蔬菜分子遗传图谱的构建
• 1.1.2.2 新品种鉴定和品种纯度分析
• 1.1.2.3 亲缘关系研究
• 1.1.2.4 基因标记及定位
• 1.1.2.5 比较基因组学的研究
• 1.1.2.6 SRAP标记其他方面的应用
• 1.1.2.7 目前蔬菜育种中存在的问题及SRAP标记应用展望
• 1.2 双向电泳技术及其在蔬菜作物蛋白质组研究中的应用
• 1.2.1 蛋白质双向电泳技术研究现状
• 1.2.1.1 蛋白制备
• 1.2.1.2 蛋白定量
• 1.2.1.3 蛋白上样及等电聚焦
• 1.2.1.4 胶条平衡及SDS-PAGE电泳
• 1.2.1.5 凝胶染色
• 1.2.2 双向电泳技术在蔬菜作物中的应用
• 1.2.2.1 在瓜果类蔬菜研究中的应用
• 1.2.2.2 在豆类蔬菜研究中的应用
• 1.2.2.3 在叶菜类蔬菜研究中的应用
• 1.2.3 讨论
• 1.3 本研究的目的及意义
• 第二章 莴苣属蔬菜资源SRAP标记PCR体系的构建与优化
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料与试剂
• 2.2.1.1 植物材料
• 2.2.2 试验方法
• 2.2.2.1 材料培养与样品制备
• 2.2.2.2 基因组总DNA的提取与检测
• 2.2.2.3 SRAP-PCR扩增
• 2.2.2.4 SRAP-PCR产物检测
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 DNA提取方法的确定
• 2.3.2 对参与SRAP反应体系的各反应物浓度的优化
• 2+和dNTPS浓度'>2.3.2.1 Mg²⁺和dNTPS浓度
• 2.3.2.2 引物浓度
• 2.3.2.3 Tag酶浓度
• 2.3.3 退火温度
• 2.3.4 PCR产物检测
• 2.3.5 SRAP-PCR体系及反应参数的稳定性检测
• 2.4 讨论
• 第三章 形态学标记和SRAP分子标记在莴苣DUS测试中的应用
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料与试剂
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.2.1 SRAP测试
• 3.2.2.2 形态学测试
• 3.2.2.3 数据收集和分析方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 SRAP扩增结果
• 3.3.2 SRAP扩增聚类分析
• 3.3.3 形态学聚类分析
• 3.3.4 分子标记与形态学标记的相关性
• 3.4 讨论
• 第四章 SRAP分子标记在西瓜DUS测试中应用的可行性验证
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料与试剂
• 4.2.2 SRAP测试
• 4.2.3 形态学测试
• 4.2.4 数据收集和分析方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 SRAP扩增结果
• 4.3.2 SRAP扩增聚类分析
• 4.3.3 形态学聚类分析
• 4.3.4 分子标记与形态学标记的相关性
• 4.4 讨论
• 第五章 适用于生菜蛋白质组分析的高分辨率双向电泳方法
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 供试材料
• 5.2.2 试剂配置
• 5.2.3 蛋白质提取
• 5.2.4 蛋白浓度测定
• 5.2.5 双向电泳
• 5.2.6 凝胶染色及分析
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 等电聚焦时间选择
• 5.3.2 不同染色方法比较
• 5.3.3 双向电泳分辨率和重复性
• 5.3.4 生菜叶片总蛋白质的特征
• 5.4 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 作者简介