猪肺免疫防御相关基因—肺表面活性蛋白A的研究

论文摘要

猪呼吸系统疾病（PRD）已成为影响全球养猪业的头号疾病,肺免疫防御相关基因的研究和挖掘对于从遗传本质上提高猪对呼吸系统疾病的抗性具有重要意义。本文利用比较基因组学方法,以肺免疫防御相关基因-猪肺表面活性蛋白A（SP-A）作为猪呼吸系统免疫防御功能的候选基因,开展了猪肺表面活性蛋白A序列及其多态性、mRNA表达和蛋白质含量变化的系列研究,取得了以下结果:①采用RT-PCR和RACE技术获得了长度为1 910 bp的猪SP-A完整cDNA序列,此序列包含了编码248个氨基酸的长为747 bp的完整开放阅读框。生物信息学分析发现,猪SP-A的N端有20个残基的信号肽,从N端到C端依次为4个结构域:短的N-端区、胶原样区域、茎区和碳水化合物识别区域。然后又用比较基因组学方法和引物步移法获得了长度为4 229 bp的猪SP-A DNA全序列,它由4个外显子和3个内含子组成。②以同一时期饲养在相同条件下的引进品种大白猪361头、培育品种松辽黑猪132头为试验群1,采用PCR-SSCP技术检测到33个单核苷酸多态性（SNPs）位点,其中有5个SNPs位于外显子上,3个为同义突变,2个为错义突变;这2个错义突变位于猪SP-A的碳水化合物识别区域,分别造成了丙氨酸变异为苏氨酸、苯丙氨酸变异为酪氨酸。这些SNPs位点呈完全连锁不平衡状态,组成了Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三种单体型。经χ2检验表明,在大白猪试验群中,SP-A的基因频率和基因型频率都达到了Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）;但是在松辽黑猪试验群中,SP-A的基因频率和基因型频率都未达到Hardy-Weinberg平衡状态（P<0.01）。目前,两个品种猪的SP-A基因都处于中度多态。在品种内,不同性别SP-A单体型频率分布差异不显著（P>0.05）。在大白猪中,SP-AⅡ单体型猪的PRD发病率最高,达33.67%,并且不同SP-A基因单体型大白猪PRD发病率差异极显著（P<0.01）;在松辽黑猪中,也是SP-AⅡ单体型猪的PRD发病率最高,为10.53%,不同SP-A基因单体型松辽黑猪的PRD发病率差异显著（P<0.05）;表明在大白猪和松辽黑猪中,单体型与PRD发病率之间存在一定的关联度。其中SP-A基因Ⅰ单体型为抗PRD单体型,推测以SP-AⅠ单体型猪具有较强的肺免疫防御功能。③通过以0.05 ml/kg体重,少量分次,耳静脉注射油酸成功建立了猪油酸-急性肺损伤模型,为进一步开展有关猪肺损伤以及肺免疫防御相关研究奠定了基础。④以包含SP-A基因Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ单体型共54头仔猪建立试验群2,在仔猪断奶稳定后50±1日龄建立油酸-急性肺损伤模型。以肺含水量的变化作为反映肺损伤程度的指标,分别采用荧光定量PCR和western blot技术对肺组织中SP-A mRNA表达量和支气管-肺泡灌洗液（BALF）中SP-A蛋白含量进行检测与分析,发现:在1 h时相点伴随肺含水量的增加,SP-A mRNA表达量和SP-A蛋白含量均下降;在3 h时相点伴随肺含水量增加至最高（3个时相点中相比较）,SP-A mRNA表达量和SP-A蛋白含量也降至三个时相点的最低水平;与1 h时相点相比较,在6 h时相点伴随肺含水量的下降,SP-A mRNA表达量和SP-A蛋白含量分别极显著上升（P<0.01）和显著上升（P<0.05）。另外,与Ⅱ和Ⅲ单体型相比较,各时相点SP-AⅠ单体型猪的肺含水量较对照组的升高幅度要小;BALF中SP-A蛋白含量较高,更接近于对照组水平;1 h和3 h时相点SP-AⅠ单体型猪肺组织中的SP-A mRNA表达量也较高,也更接近于对照组水平,并且在6 h时相点SP-AⅠ单体型猪的SP-A mRNA表达量显著高于Ⅱ和Ⅲ单体型。上述结果表明,肺组织中SP-A mRNA表达量、BALF中SP-A蛋白含量与肺含水量即肺损伤程度的变化趋势恰好相反;在同时受到病原致损伤的情况下,SP-AⅠ单体型猪的SP-A水平会在较短时间内恢复而有利于尽快缓解病原对肺的损伤,因此,推测SP-AⅠ单体型猪具有较高的应对病原损伤肺的能力。以上结果表明,猪SP-A同人、小鼠等的SP-A一样,也具有肺免疫防御功能;不同SP-A单体型与PRD发病率之间存在一定关联性,其中又以SP-AⅠ单体型的猪具有较强的肺免疫防御能力,能够使外来因素对肺脏的损伤程度降至最低,损伤时间降至最短,因而也降低了猪只由于长时间处于致病原损伤状态下而引起继发感染的可能,具有较低的PRD发病率。本研究结果首次较全面地揭示了猪SP-A的肺免疫防御功能,同时也为判断发生PRD时猪只肺损伤的程度,为PRD的临床诊断以及防治PRD新型药物的研发和选择肺免疫防御功能强的种猪个体奠定了一定的理论依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略表
• 第一章 绪论
• 1.1 猪呼吸系统疾病与肺免疫防御
• 1.1.1 猪呼吸系统疾病及其危害
• 1.1.2 控制猪呼吸系统疾病的一般措施
• 1.1.3 呼吸系统免疫防御功能的研究
• 1.1.4 肺免疫防御功能与猪呼吸系统疾病的关系
• 1.1.5 肺免疫防御相关基因
• 1.2 SP-A 研究现状
• 1.2.1 SP-A的分子结构
• 1.2.2 SP-A的分子遗传学
• 1.2.3 SP-A的合成和代谢
• 1.2.4 SP-A的局部防御和免疫调节作用
• 1.2.5 SP-A的表达调控
• 1.2.6 SP-A在人类临床医学中的研究
• 1.3 猪油酸－急性肺损伤模型
• 1.3.1 急性肺损伤
• 1.3.2 SP-A与急性肺损伤
• 1.3.3 油酸－急性肺损伤模型
• 1.4 研究目的与内容
• 1.4.1 研究目的
• 1.4.2 研究内容
• 第二章 猪SP-A cDNA的克隆与分析
• 2.1 导言
• 2.2 主要仪器和材料
• 2.2.1 主要仪器
• 2.2.2 材料
• 2.3 方法
• 2.3.1 肺组织的采集与保存
• 2.3.2 总RNA的提取
• 2.3.3 总RNA的纯化
• 2.3.4 总RNA的检测
• 2.3.5 3’RACE
• 2.3.6 5’RACE
• 2.3.7 RT-PCR
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 总RNA检测结果
• 2.4.2 3’RACE，5’RACE和RT-PCR 扩增和克隆结果
• 2.4.3 测得序列拼接与分析
• 2.5 讨论
• 2.5.1 RACE技术心得
• 2.5.2 猪SP-A的特征与功能
• 第三章 猪SP-A DNA的克隆与分析
• 3.1 导言
• 3.2 主要仪器和材料
• 3.2.1 主要仪器
• 3.2.2 材料
• 3.3 方法
• 3.3.1 猪基因组DNA的提取与检测
• 3.3.2 猪SP-A基因的PCR扩增
• 3.3.3 纯化、克隆及测序
• 3.3.4 序列分析
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 基因组DNA检测结果
• 3.4.2 PCR 扩增和克隆结果
• 3.4.3 测得序列拼接与分析
• 3.5 讨论
• 3.5.1 基因组DNA的制备
• 3.5.2 猪SP-A DNA的序列特征与功能
• 第四章 猪SP-A多态性检测与关联性分析
• 4.1 导言
• 4.2 主要仪器和材料
• 4.2.1 主要仪器
• 4.2.2 材料
• 4.3 方法
• 4.3.1 猪基因DNA的提取与检测
• 4.3.2 PCR–SSCP
• 4.3.3 纯化测序
• 4.3.4 统计分析
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 SP-A多态性检测结果
• 4.4.2 统计分析结果
• 4.5 讨论
• 4.5.1 PCR-SSCP技术
• 4.5.2 不同SP-A单体型与PRD发病率－肺免疫防御能力的关系
• 第五章 猪油酸－急性肺损伤模型的建立
• 5.1 导言
• 5.2 主要仪器和材料
• 5.2.1 主要仪器
• 5.2.2 材料
• 5.3 方法
• 5.3.1 不同油酸注射剂量的比较
• 5.3.2 不同处死方式的分析比较
• 5.3.3 建立油酸组和对照组
• 5.4 结果与分析
• 5.4.1 油酸注射剂量的确定和呼吸频率的变化
• 5.4.2 猪处死方式的选择
• 5.4.3 油酸组和对照组实验结果
• 5.5 讨论
• 5.5.1 试验对象的选择
• 5.5.2 猪油酸－急性肺损伤模型的建立
• 第六章 SP-A m RNA表达量和蛋白含量的检测
• 6.1 导言
• 6.2 主要仪器设备和材料
• 6.2.1 主要仪器设备
• 6.2.2 主要材料
• 6.3 方法
• 6.3.1 荧光定量PCR检测SP-A mRNA表达量
• 6.3.2 Western blot检测SP-A蛋白的含量
• 6.3.3 数据处理和统计分析
• 6.4 结果与分析
• 6.4.1 荧光定量PCR结果
• 6.4.2 Western blot结果
• 6.4.3 数据处理和统计分析结果
• 6.5 讨论
• 6.5.1 FQ-PCR技术
• 6.5.2 Western blot技术
• 6.5.3 血清中SP-A的检测
• 6.5.4 肺含水量的变化与肺损伤程度
• 6.5.5 肺组织中SP-A m RNA表达量的变化与肺损伤程度
• 6.5.6 BALF中SP-A含量的变化与肺损伤程度
• 6.5.7 SP-A mRNA表达量、SP-A含量与肺损伤程度之间的关系
• 第七章 全文结论
• 7.1 猪SP-A具有肺免疫防御功能
• 7.2 不同SP-A单体型猪具有不同的肺免疫防御功能
• 7.3 肺组织中猪SP-A的表达量和BALF中猪SP-A的含量与肺免疫防御功能有关
• 7.4 展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历