骨再生中羟基磷灰石材料的生物相容性研究

论文摘要

粉碎性骨折因常造成骨缺损治疗比较困难,自体骨移植造成供区缺损。骨移植供体来源中的组织工程学人工骨组织具有来源广泛,适用性强等优点而成为研究热点。组织工程研究中要素之一是种子细胞的筛选、鉴定和纯化。成骨细胞的分离、培养和鉴定已多见报道,但是在骨损伤再生愈合过程中,是否发生和存在更原始的骨祖细胞（未分化细胞）或成骨样细胞?它们的成骨性能如何?分离成骨样细胞的方法能否有所改进,这方面研究还少见文献报道,有待进一步研究。我们建立了家兔骨缺损模型,研究其骨损伤后骨再生愈合过程局部组织学形态变化,分离成骨样细胞,为骨组织工程研究提供理想的种子细胞。组织工程另一要素是生物材料支架,无机非金属类的生物材料羟基磷灰石（hydroxyapatite,HA）是骨组织中存在的天然无机物质,骨盐的主要成分,接近体内成骨微环境,在组织工程化人工骨构建中得到广泛应用。HA分子式是Ca10（PO4）6（OH）2。近年来,国内外关于HA与成骨细胞结合构建组织工程化人工骨的相关报道很多,但大部分是大体的宏观层次上的复合体性能的研究,对于HA对成骨细胞生长的毒副作用以及相关的检测手段还少见报道。HA对成骨细胞的生物相容性和二者的相互作用机制的研究还很少,为此我们进行了成骨细胞和HA复合培养,研究HA对成骨细胞生长的影响,并初步探讨其可能的分子生物学机制。不加任何修饰的HA不利于细胞生长,施加一些因素来修饰HA,提高其生物相容性,其中Ⅰ型胶原是骨组织中天然有机成分,有利于细胞粘附、生长。本实验研究PGE1（prostaglandin E1,前列腺素E1）、Dex（dexamethasone,地塞米松）和HA及Ⅰ型胶原之间相互作用对成骨细胞的粘附、增殖、信号转导、分化和凋亡的相关基因表达的影响。为骨组织工程的生物支架材料的设计提供实验参考。【目的】为骨组织工程研究提供理想的种子细胞和骨缺损模型;为骨组织工程生物材料研究提供一种新的生物材料生物相容性检测手段:探讨HA、胶原、PGE1、Dex等因素对成骨细胞相关基因表达的影响。【方法】1、制作家兔双侧前肢桡粉碎性骨折骨缺损模型,在术后14d再次手术,观察骨折断端愈合状态,分别做HE染色观察断端组织学形态变化,及分离、培养、鉴定成骨样细胞。2、HA片生物材料与小鼠MC3T3细胞复合培养,利用PI-Hoechst33342荧光染色法观察细胞凋亡情况;利用逆转录-聚合酶链反应（Reversetranscription-polymerase chain reaction,RT-PCR）的方法检测骨桥蛋白（osteopontin,OPN）和分化抑制因子（Inhibitor of differentiation/DNA binding-2,Id2）的基因表达情况,初步分析细胞凋亡的分子生物学机制。3、MC3T3成骨细胞株在与HA片、鼠尾胶以及施加PGE1和Dex处理因素复合培养,检测OPN、Id2、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）和凋亡诱导因子（apoptosisinducing factor,AIF）基因的表达差异,来初步说明上述处理因素对成骨细胞的粘附、增殖、信号转导、分化和凋亡的相关基因表达的影响。【结果】1、粉碎性骨折2周后,局部有骨痂形成,包含类骨组织和软骨性骨痂。成功分离出原代成骨样细胞,经细胞形态学和细胞化学鉴定为成骨样细胞。2、HA组的细胞凋亡平均百分率显著高于正常组。Id2在正常对照组接种的早期（5d）有明显的表达,而晚期无表达;在HA组早期Id2无表达,在晚期（15d）有较弱的表达。OPN在正常对照组和HA组的前述两个时刻均有明显表达,无显著差异。3、Ⅰ型胶原使MC3T3细胞粘附良好,不易洗脱。细胞和HA融合紧密。PGE1使细胞变长;Dex使细胞增殖明显,细胞形态变成矮柱状。HA与鼠尾胶协同作用促进了OPN的表达;HA促进了ALP和MAPK的表达;HA抑制了Id2的表达,促进成骨细胞的分化。HA促进了AIF的表达,但是PGE1可减低HA的促进AIF表达的作用。鼠尾胶协同HA促进了OPN、Id2、ALP和MAPK各基因的表达。PGE1抑制了OPN、ALP和MAPK表达,促进了Id2表达。Dex抑制了OPN和MAPK表达,促进了Id2表达,对ALP和AIF表达无显著影响。【结论】1、成功分离、培养出骨损伤后骨痂中的兔成骨样细胞,为研究骨损伤后骨再生中原始细胞的作用提供了良好的模型。2、不加修饰的HA片能够促进MC3T3成骨细胞凋亡,需要修饰改进。提供了一种原位检测不透明生物材料生物相容性的简便有效的方法。HA影响Id2的表达,在细胞生长早期通过抑制Id2的表达抑制细胞增殖,在培养晚期通过诱导Id2的表达促使细胞凋亡。3、表明HA提供了成骨细胞成骨的细胞微环境,使细胞生长良好,表现出良好的信号转导和成骨特性,同时也可促进成骨细胞凋亡,在骨重建中起一定作用。Ⅰ型胶原是良好的细胞外基质,可以促进细胞粘附、生长和基因表达。10ng/mlPGE1抑制了OPN、ALP和MAPK表达,促进了Id2表达,10-7M Dex抑制了OPN和MAPK表达,促进了Id2表达,对ALP和AIF表达无显著影响,表明这两种因素在此浓度不利于成骨细胞成骨,需要改进,摸索最佳成骨条件。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 骨损伤后的形态学观察和原代成骨样细胞株的建立和鉴定
• 研究目的
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 第二章 HA与成骨细胞复合培养后生物相容性检测
• 目的和意义
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第三章 修饰后的HA对骨部分相关基因表达的影响
• 研究目的
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 参考文献
• 文献综述
• 英文缩略词表
• 附录 攻读硕士期间发表论文及参加的学术会议
• 致谢