中国樱桃S基因型及S-RNase基因克隆表达研究

论文摘要

蔷薇科果树的大多数树种为二倍体,表现出配子体自交不亲和性。中国樱桃（Prunus psedocerasus L.）是起源于我国的自交亲和的四倍体的李属果树种质资源,具有悠久的栽培历史和丰富的品种类型。本文以中国樱桃的五个品种为试材,确定了五个品种的S基因型,克隆了花柱S-RNase cDNA的全长序列,并做Northern杂交研究S-RNase基因的表达情况,以探讨中国樱桃自交亲和的S-RNase基因的分子基础。主要结果如下:1.利用李属S-RNase基因扩增的六对引物,对参试中国樱桃品种进行PCR扩增,经过优化PCR体系, EM-PC2consFD + EM-PC3consRD、PruC2 + PCER和Pa ConsⅠ-F + Pa ConsⅡ-R在不同品种上均可扩增出2-3条较亮的带,扩增效果较好,这三对引物适宜中国樱桃S-RNase基因的扩增。2.利用引物EM-PC2consFD + EM-PC3consRD对中国樱桃五个品种的基因组DNA进行PCR扩增,并克隆扩增条带。测序结果在GenBank上进行同源性比较表明:五个品种中包含了五种不同S-RNase基因,分别为S1-RNase（631bp）、S2-RNase （1432bp）、S3-RNase （1186bp）、S4-RNase （529bp）、S5-RNase （254bp）,并在GenBank上注册,注册号分别为EU038300- EU038304。3.根据以上PCR扩增的结果,参试的5个品种经适宜引物扩增后,有3条或4条扩增带,其中包括亮带和弱带,都是中国樱桃的S-RNase基因。从而确定中国樱桃五个品种的S基因型,分别为藤县红（S1S3S4）;大青叶（S1S3S4S5）;大窝楼叶（S1S3S4）;泰小红樱（S1 S2S3S4）;莱阳矮樱（S1 S2S3S4）。4.在泰小红樱和莱阳矮樱花柱中分别克隆到中国樱桃两个S-RNase基因的cDNA全长序列,大小分别为811bp和832bp。两个基因分别包含从基因组克隆到的中国樱桃S1和S2编码区,所以分别命名为全长S1–RNase和S2–RNase,并在GenBank上注册,注册号分别为EU073938 （S1-RNase）和EU073939 （S2-RNase）。S1–RNase和S2–RNase全长序列与李属S–RNase的结构特征一致,具有蔷薇科李属S–RNase活性。5.Northern杂交结果显示在泰小红樱和莱阳矮樱花柱中分别有两个S–RNase高度表达,各有两个S–RNase没有表达。只有S1–RNase和S2–RNase有功能而S3–RNase和S4–RNase无功能,把S3–RNase和S4–RNase分别命名为S3m–RNase和S4m–RNase,‘m’表示S–RNase在花柱中突变导致的功能丧失。所以‘泰小红樱’和‘莱阳矮樱’的基因型可以写成S1S2S3mS4m。因此,无功能的花柱S基因S3m和S4m的积累可能导致中国樱桃的自交亲和。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 配子体自交不亲和性研究进展
• 1.1.1 花柱S-RNASE 基因研究进展
• 1.1.2 S-RNASE 的结构与功能
• 1.1.3 GSI 中SI 发生的可能机理
• 1.2 李属（PRUNUS）自交（不）亲和性分子基础研究进展
• 1.2.1 李属S-RNASE 基因及功能研究进展
• 1.2.2 李属不同树种S-RNASE 基因特异PCR 的引物及其应用研究进展
• 1.2.3 李属自交亲和分子基础研究
• 1.3 多倍体自交亲和性研究
• 1.4 果树多倍体的研究意义
• 1.5 本研究的内容及目标
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和培养基
• 2.1.3 酶及生化试剂
• 2.1.4 PCR 引物
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 基因组DNA 提取
• 2.2.2 S-等位基因PCR 扩增及所用引物
• 2.2.2.1 基因组S-等位基因PCR 扩增及所用引物
• 3和S₄ 基因的特异性扩增'>2.2.2.2 中国樱桃S₃和S₄基因的特异性扩增
• 2.2.3 花柱RNA 的提取
• 2.2.4 反转录CDNA 第一链的合成
• 2.2.5 3’RACE 和5’RACE 扩增及CDNA 全长的获得
• 2.2.6 S-RNASE 基因特异片段的克隆及序列分析
• 2.2.6.1 PCR 扩增产物的回收
• 2.2.6.2 连接反应
• 2.2.6.3 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.6.4 大肠杆菌感受态细胞的转化及阳性克隆的筛选测序
• 2.2.7 DNA 序列测定及S 基因的的鉴定和命名
• 2.2.8 地高辛（DIG）标记的NORTHERN 杂交分析
• 2.2.8.1 花柱总RNA 提取
• 2.2.8.2 杂交所用试剂配制
• 2.2.8.3 甲醛变性胶电泳
• 2.2.8.4 转膜
• 2.2.8.5 探针的制备
• 2.2.8.6 预杂交及杂交
• 2.2.8.7 洗膜
• 2.2.8.8 杂交结果的检测
• 3 结果与分析
• 3.1 中国樱桃S 基因型鉴定
• 3.1.1 中国樱桃S 基因扩增的引物筛选与分析
• 3.1.1.1 不同的引物组合对中国樱桃S-RNASE 基因的PCR 扩增电泳图比较
• 3.1.1.2 6 对引物对中国樱桃的扩增效果评价
• 3.1.2 中国樱桃五个品种S-RNASE 基因的鉴定
• 3.1.2.1 中国樱桃S-RNASE 基因的克隆测序
• 3.1.2.2 中国樱桃53 和54 基因的特异性扩增
• 3.1.2.3 中国樱桃五个品种的S 基因型的确定
• 3.1.3 中国樱桃 S-RNASES 氨基酸序列比较
• 3.2 中国樱桃 S-RNASE 全长克隆及表达研究
• 3.2.1 中国樱桃 S-RNASES 全长 CDNA 克隆和 NORTHERN 杂交分析
• 3.2.2 两个中国樱桃 S-RNASES 全长 CDNA 序列分析
• 4 讨论
• 4.1 李属不同树种 S-RNASE 基因特异 PCR 的引物及其应用
• 4.2 关于四倍体中国樱桃 S-RNASE 基因扩增后 PCR 条带的数量
• 4.3 关于中国樱桃S-RNases 基因的命名和S基因型的确定
• 4.4 关于花柱中S-RNase的活性
• 4.5 关于无S-RNase的活性的S-RNase基因
• 4.6 关于中国樱桃自交亲和的可能的原因
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文情况