探讨NPM1突变对白血病细胞化疗敏感性的影响及其分子机制

论文摘要

核仁磷酸蛋白（nucleophosmin，NPM1）突变是急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）中发生频率最高的基因改变。临床研究发现，携NPM1突变的白血病患者对化疗敏感，预后良好，但其具体机制尚未阐明。为探讨NPM1突变对白血病细胞化疗敏感性的影响，将携带NPM1A型突变（NPM1mA）的重组质粒载体pEGFPC1-NPM1mA转染白血病THP-1细胞系，构建稳定表达NPM1mA蛋白的细胞株（THP-1mA），同时设立空载体转染组（THP-1C1）和未处理组（THP-1）为对照。MTT实验确定化疗药物柔红霉素（DNR）及阿糖胞苷（Ara-C）的工作浓度及作用时间。FCM检测细胞凋亡率。qPCR及Western blot检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平。结果发现，在0.25μM的DNR及8.5μM的Ara-C作用24h后，与对照组细胞比较，THP-1mA细胞的凋亡率显著增高（p<0.05）；同时，THP-1mA组细胞的凋亡相关蛋白Bax表达水平显著增高（p<0.05）、Bcl-2的表达水平显著降低（p<0.05）。提示NPM1突变可通过促进细胞凋亡而参与调控白血病细胞对化疗药物的敏感性。NPM1基因突变在白血病的发生发展中发挥重要作用。我们前期研究发现，NPM1突变可通过促进细胞凋亡参与调控白血病细胞对化疗药物的敏感性。为进一步探讨其分子机制，构建稳定表达NPM1突变蛋白的白血病细胞株THP-1mA，同时设立空载体转染组（THP-1C1）和未处理组（THP-1）为对照。双荧光素酶报告基因检测各组细胞NF-κB的活性；免疫共沉淀（IP）检测NPM1突变蛋白与NF-κB的结合能力。观察NF-κB激活剂（TNF-α）作用THP-1mA细胞后，细胞凋亡率、凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平的改变。此外，qPCR检测miR-29b及其靶基因Mcl-1的mRNA水平，Western blot检测Mcl-1的蛋白水平。结果发现，与对照组比较，THP-1mA组细胞在DNR和Ara-C作用下其NF-κB蛋白的活化受阻，维持其较低的转录活性；IP实验显示大量NF-κB在胞浆中与NPM1突变蛋白结合。在TNF-α刺激之后，THP-1mA细胞凋亡率显著下降（p<0.05），Bax mRNA及蛋白表达水平明显下调（p<0.05），Bcl-2的mRNA及蛋白表达水平显著上升（p<0.05）。与对照组相比，THP-1mA组细胞的miR-29b表达水平维持在较高水平，Mcl-1的mRNA及蛋白表达持续在较低水平；而在TNF-α刺激后，miR-29b表达水平显著下调（p<0.05），Mcl-1的mRNA及蛋白水平明显升高（p<0.05）。提示NPM1突变蛋白可能通过降低NF-κB的转录活性，上调miR-29b的表达水平及降低其靶基因Mcl-1的表达；同时，增加促凋亡蛋白Bax的表达，减低抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平，最终增强白血病细胞对化疗药物的敏感性。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 探讨 NPM1 突变对白血病细胞化疗敏感性的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二部分 探讨 NPM1 突变参与调控白血病细胞化疗敏感的分子机制
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间文章发表