对虾中金葡菌及肠毒素B免疫磁快速检测法的建立与应用

论文摘要

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,简称金葡菌）及肠毒素B（SEB）对海产品的严重污染一直困扰着海产品加工企业。本研究建立S.aureus及SEB免疫磁快速检测法,并评价两种制剂（芽孢杆菌抗菌肽和蛹虫草制剂）控制效果。具体包括三方面内容：化学键法制备免疫磁珠（IMB）。人IgG与磁珠偶联制备金葡菌免疫磁珠（IMBS.aureus）; SEB标准品免疫家兔制备SEB抗体（效价为1：16）与磁珠偶联制备SEB免疫磁珠（IMBSEB）；两种IMB通过优化活化剂浓度（均为5mg/mL）、磁珠对抗体的偶联时间（24h和27h）、饱和吸附量（分别为293.27μg和318.56μg）来提高偶联率；根据免疫磁分离技术原理,结合常规细菌计数法建立IMBS.aureus快速检测法,结合间接竞争ELISA建立IMBSEB快速检测法（IMBSEB-ELISA）。IMBS.aureus快速检测法：通过优化抗体加入量（结合人IgG250μg）、IMBS.aureus对金葡菌孵育温度（37℃）、时间（60min）获得最大捕捉率,确定最低检测限为26cfu/10mL,准确度为92.81%,变异系数均小于15%。与国标法相比,IMBS.aureus法在虾肉中的应用具有高灵敏度,高效率（26.5h）的特点；IMBSEB-ELISA快速检测法：通过优化IMBSEB对SEB孵育时间（75min）获得最高捕捉量,优化最佳检测条件（包被浓度0.625μg/mL,抗体稀释度1：3000,碳酸盐缓冲液于4℃包被20h,BSA为封阻液,竞争抗原和抗体比例为7：3）,明确检测范围（5-500ng/mL）和IC50（31.04ng/mL）,确定其交叉反应<0.01%,最高阻断率为71.92%,最低检测限为3.99ng/mL,最低定量限为5ng/10mL,平均回收率为95.13%,变异系数均小于15%;IMBSEB-ELISA在虾肉中的应用具有高灵敏度的特点,准确性（平均回收率为101.66%）和精确性（变异系数为12.06%）均良好。两种制剂在S.aureus不同生长时期加入,利用两种免疫磁法检测菌及毒素含量变化。结果表明,芽孢杆菌抗菌肽和蛹虫草制剂MIC值分别为0.675mg/mL和25mg/mL。两种制剂均可有效控制金葡菌前20h的生长,芽孢杆菌抗菌肽可控制毒素含量；蛹虫草制剂在低菌浓度时可控制毒素含量。综上所述,免疫磁快速检测法为食源性致病菌及毒素的痕量检测提供了新的研究思路,为有效评价生物制剂对海产品的绿色安全控制提供了保障。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 金黄色葡萄球菌及其肠毒素研究进展
• 1.1.1 金黄色葡萄球菌生物学特性
• 1.1.2 金黄色葡萄球菌肠毒素生物学特性
• 1.1.3 金黄色葡萄球菌肠毒素致病性
• 1.1.4 金黄色葡萄球菌及毒素的流行特点
• 1.1.5 海产品中金黄色葡萄球菌及其毒素污染海产品现状
• 1.1.6 金黄色葡萄球菌及肠毒素检测方法研究进展
• 1.1.6.1 金黄色葡萄球菌检测方法研究进展
• 1.1.6.2 金黄色葡萄球菌肠毒素检测方法研究进展
• 1.2 免疫磁快速检测技术研究进展
• 1.2.2 免疫磁珠分离技术简介
• 1.2.3 免疫磁珠技术在食品微生物检测中的应用
• 1.3 两种微生物制剂研究进展
• 1.3.2 芽孢杆菌抗菌肽研究进展
• 1.3.3 蛹虫草研究进展
• 1.4 研究意义与目的
• 1.5 研究内容
• 第二章 金黄色葡萄球菌及肠毒素B免疫磁珠的制备
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.1.2 原料
• 2.1.1.3 试剂
• 2.1.1.4 仪器
• 2.1.1.5 溶液配制方法
• S.aureus)的制备'>2.1.1 金黄色葡萄球菌免疫磁珠(IMB_S.aureus)的制备
• 2.1.1.2 原理
• 2.1.1.3 人IgG与磁珠偶联的基本步骤
• 2.1.1.4 活化剂对磁珠的活化效果
• 2.1.1.5 人IgG与磁珠偶联效果评价
• SEB)的制备'>2.1.2 金黄色葡萄球菌肠毒素B免疫磁珠(IMB_SEB)的制备
• 2.1.2.2 原理
• 2.1.2.3 金黄色葡萄球菌肠毒素B抗血清的制备
• 2.1.2.4 SEB抗血清与磁珠偶联基本步骤
• 2.1.2.5 SEB抗血清与磁珠偶联效果评价
• 2.2 结果与分析
• S.aureus制备效果'>2.2.1 IMB_S.aureus制备效果
• 2.2.1.2 活化剂对磁珠分离效果
• 2.2.1.3 人IgG与磁珠偶联效果评价
• 2.2.2 金黄色葡萄球菌肠毒素免疫磁珠的制备效果
• 2.2.2.2 anti-SEB效价结果
• 2.2.2.3 anti-SEB与磁珠偶联效果评价
• 2.3 结论
• 2.3.1 抗体与磁珠偶联一般步骤
• 2.3.2 金黄色葡萄球菌免疫磁珠的制备
• 2.3.3 金黄色葡萄球菌肠毒素免疫磁珠的制备
• 2.4 讨论
• 第三章 金黄色葡萄球菌及肠毒素B免疫磁法的建立
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.1.2 原料
• 3.1.1.3 试剂
• 3.1.1.4 仪器
• 3.1.1.5 溶液系统
• 3.1.2 金黄色葡萄球菌免疫磁快速检测的建立
• S.aureus法检测S.aureus的基本步骤'>3.1.2.2 IMB_S.aureus法检测S.aureus的基本步骤
• S.aureus分离S.aureus的条件优化'>3.1.2.3 IMB_S.aureus分离S.aureus的条件优化
• S.aureus快速检测法分离S.aureus的效果评价'>3.1.2.4 IMB_S.aureus快速检测法分离S.aureus的效果评价
• S.aureus快速检测法在对虾中的应用'>3.1.2.5 IMB_S.aureus快速检测法在对虾中的应用
• SEB-ELISA)的建立'>3.1.3 肠毒素B免疫磁快速检测法(IMB_SEB-ELISA)的建立
• SEB-ELISA检测SEB的基本步骤'>3.1.3.2 IMB_SEB-ELISA检测SEB的基本步骤
• SEB-ELISA检测SEB条件优化'>3.1.3.3 IMB_SEB-ELISA检测SEB条件优化
• SEB-ELISA检测SEB的标准曲线'>3.1.3.4 制备IMB_SEB-ELISA检测SEB的标准曲线
• SEB-ELISA检测SEB的效果评价'>3.1.3.5 IMB_SEB-ELISA检测SEB的效果评价
• SEB-ELISA快速检测法在对虾中的应用'>3.1.3.6 IMB_SEB-ELISA快速检测法在对虾中的应用
• 3.2 结果与分析
• S.aureus免疫磁快速检测法的建立'>3.2.1 IMB_S.aureus免疫磁快速检测法的建立
• S.aureus分离S.aureus的条件优化'>3.2.1.2 IMB_S.aureus分离S.aureus的条件优化
• S.aureus分离S.aureus的效果评价'>3.2.1.3 IMB_S.aureus分离S.aureus的效果评价
• S.aureus快速检测法在对虾中的应用'>3.2.1.4 IMB_S.aureus快速检测法在对虾中的应用
• SEB-ELISA快速检测法的建立'>3.2.2 IMB_SEB-ELISA快速检测法的建立
• SEB-ELISA对SEB检测条件的优化'>3.2.2.2 IMB_SEB-ELISA对SEB检测条件的优化
• SEB-ELISA检测SEB标准曲线的制备'>3.2.2.3 IMB_SEB-ELISA检测SEB标准曲线的制备
• SEB-ELISA检测SEB的效果评价'>3.2.2.4 IMB_SEB-ELISA检测SEB的效果评价
• SEB-ELISA在对虾中的应用'>3.2.2.5 IMB_SEB-ELISA在对虾中的应用
• 3.3 结论
• S.aureus法检测金黄色葡萄球菌方法的建立'>3.3.1 IMB_S.aureus法检测金黄色葡萄球菌方法的建立
• S.aureus法检测金黄色葡萄球菌的最优条件及步骤'>3.3.1.2 IMB_S.aureus法检测金黄色葡萄球菌的最优条件及步骤
• S.aureus法检测金黄色葡萄球菌的效果评价'>3.3.1.3 IMB_S.aureus法检测金黄色葡萄球菌的效果评价
• S.aureus法检测对虾中金黄色葡萄球菌的应用'>3.3.1.4 IMB_S.aureus法检测对虾中金黄色葡萄球菌的应用
• SEB-ELISA法检测SEB方法的建立'>3.3.2 IMB_SEB-ELISA法检测SEB方法的建立
• SEB-ELISA法检测SEB的最优条件及步骤'>3.3.2.2 IMB_SEB-ELISA法检测SEB的最优条件及步骤
• SEB-ELISA法检测SEB的效果评价'>3.3.2.3 IMB_SEB-ELISA法检测SEB的效果评价
• SEB-ELISA法检测对虾中SEB的应用'>3.3.2.4 IMB_SEB-ELISA法检测对虾中SEB的应用
• 3.4 讨论
• S.aureus法检测金黄色葡萄球菌方法的建立'>3.4.1 IMB_S.aureus法检测金黄色葡萄球菌方法的建立
• SEB-ELISA法检测SEB方法的建立'>3.4.2 IMB_SEB-ELISA法检测SEB方法的建立
• 第四章 免疫磁法评价两种制剂抑制效果
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.1.2 原料
• 4.1.1.3 试剂
• 4.1.1.4 培养基
• 4.1.2 芽孢杆菌抗菌肽的制备
• 4.1.2.2 芽孢杆菌抗菌肽发酵方法
• 4.1.2.3 芽孢杆菌抗菌肽提纯方法
• 4.1.3 蛹虫草制剂的制备
• 4.1.4 两种微生物制剂对凡纳滨对虾中金葡菌及毒素的控制效应
• 4.1.4.2 两种微生物制剂MIC值的测定
• 4.1.4.3 两种生物制剂对虾肉中金葡菌及肠毒素B的控制效应
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 两种微生物制剂对金葡菌的MIC值
• 4.2.1.2 芽孢杆菌抗菌肽MIC值测定
• 4.2.1.3 蛹虫草制剂MIC值测定
• 4.2.2 两种生物制剂对虾肉中金葡菌及肠毒素B的控制效应
• 4.3 结论
• 4.3.1 抗菌肽制剂对虾肉中金黄色葡萄球菌及毒素控制效果
• 4.3.2 蛹虫草制剂对虾肉中金黄色葡萄球菌及毒素控制效果
• 参考文献
• 致谢
• 附录