嗜热厌氧杆菌工程菌Δldh发酵廉价生物质产乙醇的研究

论文摘要

石油危机、石油价格波动及温室效应等问题日益突出,发展生物质能源成为人类寻求可持续发展能源的重要方向,其中生物乙醇作为绿色能源的角色日渐显著。然而,耕地、人口问题以及世界粮食供应的日趋紧张要求发展第二代生物乙醇来代替传统的以粮食为原料的第一代生物乙醇。纤维素资源是重要的生物质资源,其水解成分中三分之一为木糖,木糖在生物乙醇生产中的有效利用将有利于推动乙醇生产原料的理性更替,以及纤维素资源的成功工业化转化。嗜热厌氧杆菌可以利用水解液中的木糖成分,成为利用木糖发酵生产乙醇的理想候选菌株。本课题组通过敲除野生型嗜热厌氧杆菌乳酸支路中的乳酸脱氢酶,得到嗜热厌氧杆菌工程菌Δldh的菌株,成功实现了乙醇的发酵积累。本论文以提高工程菌的乙醇产量、降低生产成本为目标,通过优化培养基成分来提高乙醇产量,然后通过优化木薯淀粉和木薯渣的水解工艺条件,以此水解液为碳源,通过5 L机械式搅拌罐分批补料发酵研究该工程菌在水解液中的发酵动力学情况。首先,利用响应面法优化嗜热厌氧杆菌工程菌Δldh产乙醇的培养基。在单因素实验基础上,采用Plackett-Burman设计对影响嗜热厌氧杆菌工程菌Δldh发酵产乙醇的重要培养基组分进行了筛选,确定主要影响因子为葡萄糖、木糖和酵母提取物。其次,用最陡爬坡实验逼近最大响应区域。最后用中心组合设计和响应面分析法,确定了主要影响因子的浓度。优化后的培养基组分为:葡萄糖13.07 g/L,木糖9.58 g/L,酵母提取物3.78 g/L;其他组分浓度同MTC培养基,但不添加一水半胱氨酸盐酸盐和二盐酸吡哆胺。在此培养基条件下,乙醇产量和生物量分别为6.102±0.21 g/L和2.87±0.16 g/L,分别是优化前产量的1.46和1.53倍。对木薯淀粉和木薯渣的水解条件进行摸索,在保证嗜热厌氧杆菌工程菌Δldh可以生长的条件下,木薯渣的最优酸水解预处理条件为:0.1 mol/L盐酸0.1 MPa ,121℃水解30 min;此条件下水解还原糖得率为50.2±1.5%。在121℃,0.1 MPa条件下,利用0.05 mol/L盐酸处理木薯淀粉30 min,水解还原糖得率为98.1±2.1%。最后以木薯淀粉水解液为底物分批补料发酵,其它成分同优化后培养基,分两次添加木薯淀粉水解液共含葡萄糖94.90 g/L,经过132 h的发酵,葡萄糖消耗76.29 g/L,乙醇产量23.48 g/L,乙醇得率0.31 g/g葡萄糖或0.15 g/g木薯淀粉,乙醇产率0.24 g/（L·h）。木薯渣水解液分批补料发酵中,分两次添加水解液共含葡萄糖68.63 g/L,木糖16.55 g/L,经过132 h发酵,葡萄糖消耗64.65 g/L,木糖消耗完,乙醇产量22.03 g/L,乙醇得率0.10 g/g木薯渣,乙醇产率0.18 g/（L·h）。以单葡萄糖为底物分批补料发酵,经过108 h发酵,葡萄糖消耗81.38 g/L,乙醇产量25.43 g/L,乙醇得率为0.31 g/g葡萄糖,乙醇产率0.30 g/（L·h）。以葡萄糖和木糖配比为2:1的混合糖为底物的分批补料发酵中,总葡萄糖为64.51 g/L,木糖为32.54 g/L,葡萄糖消耗56.13 g/L,木糖消耗27.27 g/L,乙醇产量22.03 g/L,乙醇得率0.26 g/g糖,乙醇产率0.26 g/（L·h）;以木薯淀粉水解液作为碳源底物与以单葡萄糖作为碳源底物分批补料发酵相比,乙醇产量没有明显下降;以木薯渣水解液为碳源底物分批补料发酵与葡萄糖和木糖作为混合碳源的分批补料发酵相比,利用嗜热厌氧代谢工程菌Δldh进行发酵的乙醇产量也没有明显下降。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 乙醇的生产工艺及国内外生产状况
• 1.3 微生物法发酵产乙醇的研究进展
• 1.3.1 生产菌株
• 1.3.2 代谢途径
• 1.3.3 遗传改造
• 1.4 嗜热厌氧杆菌工程菌（Thermoanaerobacterium aotearoense △ldh ）
• 1.5 生物质资源开发
• 1.6 发酵工艺
• 1.7 本课题的研究意义和研究内容
• 1.7.1 目的意义
• 1.7.2 研究内容
• 第二章 实验材料及方法
• 2.1 实验菌种
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 主要仪器设备
• 2.2.2 主要试剂及标准品
• 2.3 培养基及培养条件
• 2.3.1 主要培养基
• 2.3.2 Thermoanaerobacterium aotearoense Δldh培养
• 2.4 分析测定方法
• 2.4.1 培养基pH测定
• 2.4.2 细胞密度测定
• 2.4.3 菌体干重的测定
• 2.4.4 碳源浓度及产物浓度测定
• 2.4.5 还原糖得测定-3，5 二硝基水杨酸法[69]
• 2.4.6 Thermoanaerobacterium aotearoense Δldh光密度与干重的关系
• 2.4.7 发酵参数的定义
• 2.5 菌体生长的评价参数
• 2.5.1 比生长速率（specific growth rate）
• 2.5.2 世代时间td
• 2.6 数据分析处理方法
• 第三章 Thermoanaerobacterium aotearoense Δldh 生长特性研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 实验材料
• 3.2.3 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 Thermoanaerobacterium aotearoense Δldh 培养条件
• 3.3.2 Thermoanaerobacterium aotearoense Δldh 底物利用情况
• 3.3.3 葡萄糖为底物菌体的生长曲线
• 3.3.4 木糖为底物菌体的生长曲线
• 3.4 本章小结
• 第四章 响应面优化Thermoanaerobacterium aotearoense Δldh 发酵产乙醇的培养基
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌种
• 4.2.2 培养基
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 单因素实验
• 4.3.2 Packett-Burman实验设计
• 4.3.3 最陡爬坡实验
• 4.3.4 响应面分析
• 4.3.5 分析测定方法
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 单因素实验结果
• 4.4.2 Packett-Burman结果
• 4.4.3 最陡爬坡实验结果
• 4.4.4 中心组合设计和响应面分析
• 4.5 本章小结
• 第五章 木薯淀粉和木薯渣的稀酸水解
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 菌种
• 5.2.2 实验材料
• 5.2.3 实验方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 木薯淀粉的稀酸水解
• 5.3.2 木薯渣的稀酸水解
• 5.4 本章小结
• 第六章 Thermoanaerobacterium aotearoense Δldh发酵木薯淀粉及木薯渣水解液生产乙醇
• 6.1 引言
• 6.2 材料和方法
• 6.3 实验方法
• 6.3.1 罐上发酵实验
• 6.3.2 分析测定方法
• 6.4 结果与讨论
• 6.4.1 木薯淀粉水解液为底物分批发酵
• 6.4.2 木薯渣为底物分批发酵
• 6.4.3 以葡萄糖为底物的分批补料发酵
• 6.4.4 以葡萄糖和木糖混合碳源为底物的分批补料发酵
• 6.4.5 木薯淀粉水解液分批补料发酵
• 6.4.6 木薯渣水解液分批补料发酵
• 6.5 本章小结
• 结论
• 展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间的研究成果
• 致谢
• 附件