嗜热脂肪芽孢杆菌中普鲁兰酶的分离纯化及性质研究

论文摘要

普鲁兰酶（Pullulanase,EC.3.2.1.41）是脱支酶的一种,它能专一性水解普鲁兰多糖和支链淀粉分支点上的α-1,6糖苷键,在淀粉糖化工业中具有广阔的应用前景。本实验分离纯化了嗜热脂肪芽孢杆菌中的普鲁兰酶。嗜热脂肪芽孢杆菌经细胞破碎机破壁后,采用硫酸铵盐析法除杂蛋白,DEAE-32阴离子交换纤维素纯化胞内普鲁兰酶。通过L9（34）正交试验优化了盐析除杂蛋白工艺条件。结果表明:菌体与缓冲液比1:3、硫酸铵饱和度40%、pH7.0分离效果最佳,其中pH值对分离效果的影响差异性显著（F >F0.05）;纯化后的普鲁兰酶比活力为26.50 U/mg,纯化倍数为8.01,回收率为73%;经SDS-PAGE检测,显示一条电泳区带,相对分子质量为55.4kDa,表明获得了纯酶。对获得的嗜热脂肪芽孢杆菌普鲁兰酶进行了酶学性质测定。结果显示:最适温度为60℃,热稳定性强,60℃处理90min,残存酶活在70%以上,70℃的半衰期大于50 min;最适pH5.6,酸稳定性较好,在pH4.5～6.0的范围50℃保温24h仍具有较高活性;Km为0.036μmol/L,Vmax为20.16μmol/min;Mn2+、Mg2+和Ca2+对酶有激活作用,其中以Mn2+的激活作用最强,而Cu2+和Zn2+则有抑制作用。表明嗜热脂肪芽孢杆菌普鲁兰酶是高温酸性酶,对底物有较强亲合力和催化活性,在淀粉糖化工业中有良好的应用前景。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 第一章 文献综述
• 1 淀粉的结构
• 2 淀粉的水解酶
• 2.1 α-淀粉酶
• 2.2 β-淀粉酶
• 2.3 葡萄糖淀粉酶
• 2.4 脱支酶
• 3 淀粉的加工
• 4 普鲁兰酶
• 5 普鲁兰酶的研究现状
• 5.1 植物普鲁兰酶即极限糊精酶的研究现状
• 5.2 微生物普鲁兰酶的研究现状
• 5.2.1 耐酸耐热普鲁兰酶的生产菌种
• 5.2.2 碱性普鲁兰酶的主要产生菌种
• 5.2.3 厌氧菌
• 5.3 基因工程技术在普鲁兰酶研究领域应用概况
• 6 普鲁兰酶的作用及其生产应用
• 6.1 普鲁兰酶的脱支链作用
• 6.2 普鲁兰酶与β-淀粉酶配合使用
• 6.3 普鲁兰酶与糖化酶的配合使用
• 6.4 普鲁兰酶用于啤酒生产
• 7 普鲁兰酶的发展前景
• 第二章 嗜热脂肪芽孢杆菌中普鲁兰酶的分离纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 仪器与设备
• 1.1.4 培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 嗜热脂肪芽孢杆菌的培养及破碎
• 1.2.2 酶比活力测定方法的建立
• 1.2.3 嗜热脂肪芽孢杆菌内普鲁兰酶的分离
• 1.2.4 DEAE-32 纤维素离子交换层析纯化酶
• 1.2.5 SDS-PAGE电泳检测酶纯度
• 2 结果与分析
• 2.1 嗜热脂肪芽孢杆菌的培养及菌体破碎
• 2.2 酶比活力的测定方法的建立
• 2.2.1 葡萄糖标准曲线
• 2.2.2 蛋白含量标准曲线
• 2.3 硫酸铵盐析法分离普鲁兰酶
• 2.4 DEAE-32 纤维素离子交换层析纯化普鲁兰酶
• 2.5 SDS-PAGE 检测酶纯度与分子量
• 3 讨论
• 第三章 嗜热脂肪芽孢杆菌普鲁兰酶酶学性质研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 普鲁兰酶
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 普鲁兰酶的最适作用温度
• 1.2.2 普鲁兰酶的最适作用pH 值
• 1.2.3 普鲁兰酶的热稳定性
• 1.2.4 普鲁兰酶的酸稳定性
• 1.2.5 金属离子对普鲁兰酶活性的影响
• 1.2.6 普鲁兰酶动力学参数的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 酶的最适作用温度和 pH 值
• 2.2 酶的热稳定性
• 2.3 酶的酸稳定性
• 2.4 金属离子对酶活性的影响
• 2.5 酶的 Km 值和 Vmax
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 导师简介