论文摘要
背景和目的:子宫内膜癌（endometrial carcinoma）是三大常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一,约占女性恶性肿瘤的7%,占女性生殖系统恶性肿瘤的20-30%,近年来其发病率在世界范围内呈上升趋势,且发病年龄有年轻化的趋势,其病死率也有所升高,严重危害女性的健康[1]。尽管子宫内膜癌的预后要比卵巢癌、宫颈癌等女性生殖系统恶性肿瘤要好,但是子宫内膜癌的5年生存率仍不令人满意,FIGO分期为I-II期的子宫内膜癌患者的5年生存率在为83%,III期则为73%,IV期仅为62%[2],因此对子宫内膜癌的早期诊断、早期治疗显得尤为重要。然而目前子宫内膜癌的发病原因及机制尚未完全阐明,而且目前用于子宫内膜癌的早期诊断及治疗后监测的生物学指标诊断敏感度低。因此从基因水平进行早期诊断及治疗已成为国内外各大研究机构的热点课题。MMSET（multiple myeloma SET）基因是新近被发现的一个与肿瘤的发生发展及侵袭转移密切相关的原癌基因,在肿瘤的发生发展过程中起着重要作用。研究表明,MMSET在胶质母细胞瘤、肺癌、结肠癌、肝癌及前列腺癌等多种人类恶性肿瘤中高表达,而且与部分恶性肿瘤的预后密切相关。然而,至今MMSET基因与子宫内膜癌发生发展及侵袭能力的关系国内外仍缺乏相关研究。本研究的目的是:（1）研究MMSET蛋白在正常子宫内膜组织及子宫内膜癌组织中的表达水平,并分析MMSET蛋白的表达水平与子宫内膜癌患者年龄、FIGO分期、组织学类型、病理分级、淋巴结转移、子宫肌层浸润深度、血管/淋巴管浸润、复发及子宫内膜癌患者预后之间的关系;（2）筛选稳定高表达MMSET的子宫内膜癌细胞株,构建针对MMSET基因的特异性重组sh RNA表达质粒,转染筛选出的子宫内膜癌细胞,筛选稳定表达重组sh RNA质粒的细胞,为下一步研究MMSET基因对子宫内膜癌细胞侵袭能力的影响奠定实验基础;（3）采用RNA干扰技术研究子宫内膜癌细胞中MMSET基因沉默后对子宫内膜癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。材料和方法:（1）本研究第一部分应用免疫组织化学SP法检测62例正常子宫内膜组织、161例子宫内膜癌组织中MMSET蛋白的表达情况。（2）本研究第二部分应用Western blot筛选出高表达MMSET的子宫内膜癌细胞,以质粒p IRES2-EGFP为基础构建MMSET sh RNA的表达载体,并将其转染至子宫内膜癌细胞,G418筛选稳定表达该载体的细胞株,并应用Western blot技术鉴定干扰效果。（3）本研究第三部分采用MMT法和单细胞平板克隆形成实验检测MMSET基因沉默后子宫内膜癌细胞增殖能力的变化;采用单层细胞划痕实验检测MMSET基因沉默后子宫内膜癌细胞迁移能力的变化;采用Transwell小室细胞侵袭实验检测MMSET基因沉默后子宫内膜癌细胞侵袭能力的变化。结果:（1）MMSET蛋白在子宫内膜癌组织中的表达水平明显高于其在正常子宫内癌组织中的表达水平（P<0.001）。（2）MMSET蛋白的表达水平与子宫内膜癌患者的年龄及组织学类型无关（P>0.05）;其表达水平与病理分级、FIGO分期、淋巴结转移、肌层浸润深度、血管/淋巴管浸润、复发以及患者的不良预后密切相关（P<0.05）。（3）Western blot技术检测结果示MMSET蛋白在HEC-1A、HEC-1B及ECC-1细胞中的相对表达量分别为0.972±0.028、1.265±0.043及0.904±0.023,在子宫内膜癌HEC-1B细胞中表达水平最高,故本实验选定子宫内膜癌HEC-1B细胞作为研究对象。（4）利用软件设计合成了MMSET的特异性干扰片段,并成功构建p IRES2-EGFPMMSET sh RNA表达载体,将其转染至子宫内膜癌HEC-1B细胞,倒置荧光显微镜检测转染效率为60-70%,Western blot结果提示干扰组MMSET的表达在蛋白水平均明显低于对照组（t=28.975,P<0.001）,干扰成功。（5）从第3天开始,干扰组细胞的OD值显著低于对照组细胞（P<0.05）。细胞生长曲线显示:干扰组细胞的生长速度明显慢于对照组（P<0.05）。（6）培养2周后,于低倍显微镜（100×）计数大于10个细胞的克隆数,计算细胞克隆形成率,转染空质粒的对照组HEC-1B细胞组的克隆形成率为:（84.23±8.62）%,实验组MMSET sh RNA组细胞的克隆形成率为（39.45±4.37）%,与对照组相比,实验组的单细胞克隆集落形成率显著降低（t=10.361,P<0.001）。（7）干扰组细胞的划痕距离明显宽于对照组（图15及图16）,对照组细胞迁移了（23.23±1.75）%,而干扰组细胞迁移了（15.72±3.12）%,干扰组细胞的侧向迁移能力显著低于对照组,差异有统计学意义（t=4.694,P<0.01）。（8）在包被Matrigel基质胶的聚碳酸酯膜的下室计数出的细胞个数分别为:实验组p IRES2-EGFPMMSET sh RNA组为（16.3±2.8）,对照组空质粒转染的HEC-1B细胞组为（39.4±4.2）。与对照组细胞相比,聚碳酸酯膜的下室的实验组细胞明显减少（t=10.231,P<0.001）,差异有统计学意义。结论:（1）子宫内膜癌组织中MMSET蛋白的表达明显升高,其表达与子宫内膜癌的病理分级、FIGO分期、淋巴结转移、肌层浸润深度、血管/淋巴管浸润、复发以及患者的不良预后密切相关（P<0.05）,提示MMSET基因可能参与了子宫内膜癌发生发展及侵袭转移的过程,可能成为预测子宫内膜癌预后的一项重要生物学指标。（2）成功构建针对MMSET基因的特异性sh RNA的表达载体,并成功筛选获得稳定表达MMSET sh RNA质粒的子宫内膜癌细胞,为下一步研究MMSET对子宫内膜癌增殖、迁移及侵袭能力的影响奠定了实验基础。（3）MMSET基因沉默后可明显抑制子宫内膜癌HEC-1B细胞的增殖、迁移及侵袭能力,表明MMSET可能参与了子宫内膜癌的发生发展及侵袭转移,提示MMSET具有作为子宫内膜癌预防及治疗的基因靶点的潜在可能性,为子宫内膜癌潜在的分子靶向治疗提供一定的理论基础。