论文摘要
研究背景及目的肝纤维化是各种慢性肝病肝硬化发展的必经阶段。病毒、乙醇、寄生虫、铜铁沉积、化学毒物、胆汁淤积以及营养不良等原因长期反复作用,导致慢性肝损伤,引发肝星状细胞（HSC）激活、增殖和细胞外基质（ECM）特别是Ⅰ、Ⅲ胶原的过度合成而降解相对不足,使ECM在肝内过多沉积引起肝纤维化。转化生长因子-β1（TGF-β1）介导的信号通路在HSC激活以及ECM的产生中起重要作用。临床上有效的抗肝纤维化药物不多,秋水仙喊、糖皮质激素、青霉胺等抗肝纤维化的药物临床疗效不十分肯定,且严重副作用较多,从而限制了其在临床的应用。中草药及其单体抗肝纤维化的研究一直比较活跃,迄今为止,已经发现一些中草药具有抗肝纤维化的作用,如苦参碱、丹参、柴胡等。槐果碱是从中药苦豆子中提取的一种苦参型生物碱。近年来,研究表明槐果碱有明显抗柯萨奇B病毒（CVB）的作用及免疫调节功能。在体外100mg/L以上浓度时有明显的抗SARS病毒的作用。此外,槐果碱具有抑制HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的作用,对HepG2.2.15细胞分泌HBeAg的抑制率明显优于拉米夫定。关于其是否具有抗肝纤维化作用未见报道。本研究主要探讨槐果碱对大鼠肝纤维化模型纤维化进程的抑制作用及可能机制。研究方法1、体内实验:20mg/kg槐果碱干预二甲基亚硝胺（DMN）及胆总管结扎（BDL）致实验性大鼠肝纤维化模型,三周后处死,检测各组血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（TB）和直接胆红素（DB）;HE染色及Masson染色评估各组肝纤维化病理进程;碱水解法检测肝组织中羟脯氨酸（HP）含量;免疫组化检测α—平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及I型胶原表达:RT-PCR检测α-SMA、TGF-β1及I型前胶原α1mRNA表达。2、体外实验:采用改良Fredimen法分离、培养大鼠HSC,抗desmin免疫细胞化学染色法鉴定HSC;RT-PCR检测槐果碱干预大鼠原代培养HSCα-SMA、TGF-β1及I型前胶原α1mRNA表达,免疫荧光检验槐果碱干预后desmin及α-SMA表达;CellCounting Kit-8（CCK-8）及5-溴,2-脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）检测槐果碱对活化大鼠HSC增殖的影响。研究结果1、肝功能结果显示DMN模型大鼠血清ALT、AST及TB水平明显高于正常组大鼠（P＜0.01）,槐果碱干预后ALT、AST及TB明显下降（P＜0.05）:BDL模型大鼠血清ALT、AST、TB及DB明显高于正常组及假手术组（P＜0.01）,槐果碱干预后ALT及AST明显下降（P＜0.05）。2、HE染色显示槐果碱干预组与各模型组相比,肝纤维化程度明显减轻（P＜0.05）。Masson染色显示槐果碱干预组较各模型组纤维染色面积比明显下降（P＜0.05）,槐果碱干预DMN组的纤维染色面积比为8.76%±0.73%,DMN模型组为19.73%±1.39%,两组有显著差异;槐果碱干预BDL组的纤维染色面积比为9.98%±0.71%,BDL模型组为16.45%±1.57%,两组有显著差异。肝组织羟脯氨酸含量结果显示槐果碱干预组较各模型组羟脯氨酸含量明显下降（P＜0.05）,槐果碱干预DMN组肝组织羟脯氨酸含量为261.17±20.45μg/g肝湿重,DMN模型组为61.17±20.55μg/g肝湿重,两组有显著差异;槐果碱干预BDL组肝组织羟脯氨酸含量为163±17.03μg/g肝湿重,BDL模型组为259.33±23.18μg/g肝湿重,两组有显著差异。3、槐果碱干预组肝组织中α-SMA、TGF-β1及I型前胶原α1mRNA表达较各模型组明显降低（P＜0.05）,槐果碱干预DMN组较DMN模型组上述mRNA表达分别下降31.9%、32.5%及29.3%;槐果碱干预BDL组较BDL模型组上述mRNA表达分别下降34.8%、21.8%及16.3%。槐果碱干预组α-SMA及I型胶原蛋白表达较各模型组下降。4、分离的大鼠HSC细胞得率为5～6×107/肝,细胞存活率95%以上,细胞纯度90%以上。5、用TGF-β1（1ng/ml）处理原代培养的HSC,可使HSC表达α-SMA、TGF-β1及I型前胶原α1mRNA量明显升高（P＜0.05）,而用200mg/L槐果碱干预后HSC表达α-SMA,TGF-β1及I型前胶原α1的mRNA量显著降低（P＜0.05）,且400mg/L槐果碱组mRNA表达量明显低于200mg/L槐果碱组（P＜0.05）,提示剂量依赖效应。200mg/L槐果碱干预72h后,HSC表达α-SMA蛋白较对照组下降。5、400～1000 mg/L槐果碱对活化大鼠HSC增殖具有剂量、时间依赖的抑制作用（P＜0.05）。研究结论1.以20mg/kg槐果碱干预DMN及BDL所致大鼠肝纤维化模型,可显著改善肝纤维化大鼠肝功能,减轻大鼠肝纤维化程度。2.槐果碱可明显抑制体外原代培养的大鼠HSCα-SMA、TGF-β1及I型胶原的表达,抑制HSC活化,并可明显抑制大鼠活化HSC的增殖。3.槐果碱对HSC活化、增殖的抑制作用可能是其抗肝纤维化作用的重要机制之一。
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