罹病茎瘤芥腈水解酶基因克隆及动态表达RT-qPCR分析

论文摘要

茎瘤芥（榨菜）是我国的特色作物,涪陵榨菜是涪陵区产业中的优势、支柱产业,在农村经济中具有重要地位,但是近年来,重庆涪陵及国内其他地区的榨菜产量受到根肿病的严重影响,造成一定的经济损失。十字花科根肿病是一种土传病害,主要侵染十字花科作物,而且土壤一旦受到根肿菌的感染,带菌时间较长,不再适宜十字花科作物的种植。化学防治在一定程度上可以防治根肿病,但不能彻底根治,所以为了彻底控制根肿病的发生,当务之急是了解根肿病的致病机理。根肿病的典型特征是根部肿瘤的形成,主要是生长素和细胞分裂素的过度合成,腈水解酶是合成生长素途径中的关键酶,将吲哚-3-乙腈（IAN）转化为吲哚乙酸（IAA）,近年来成为研究的热点。本研究采用人工接种根肿菌接种体的方法,以茎瘤芥健根和病根为实验材料,采用Real-time PCR技术,用稳定表达的管家基因作为内参基因,分析腈水解酶基因的动态表达情况,探索腈水解酶与根肿病发病的关系,以期为研究根肿病的致病机理提供依据。为了获得各期根肿病发病材料,采用珍珠岩加MS培养液建立了无土快繁人工种植体系,为大量培养茎瘤芥幼苗用于致病性测试提供了均一化接种材料。当茎瘤芥生长至四片真叶时,处理组每钵人工接种500毫升（108个孢子/mL）根肿菌接种体,对照组加入等量的灭菌水,分别在处理后10,15,20,25,30和40天时,收获茎瘤芥的根,为本研究的实验材料。设计筛选内参基因和腈水解酶基因引物,优化退火温度,并制作标准曲线,通过获得扩增效率和相关系数值进一步验证引物。定期收获茎瘤芥的根,提取总RNA,进行DNase酶处理,RNA纯化,合成cDNA一链,以此为模板用筛选得到的引物对,采用荧光定量PCR技术对内参基因和腈水解酶基因进行扩增。经geNorm和NormFinder软件分析内参基因的稳定性,筛选稳定表达的内参基因,用于腈水解酶基因的表达量矫正。geNorm软件分析结果表明:ACT和UBE在处理组和对照组共12个样品中,表达最稳定,其次是RPL2,NADH表达变化最大;而NormFinder软件分析结果表明3个最稳定的内参依次为RPL2、ACT、UBE,综合上述结果,确定了以ACT、UBE和RPL2为内参基因,将腈水解酶表达数据用IQ5软件分析,分析结果表明,BjNIT1在接种根肿菌接种体后20天的病株根部,表达量开始增加,而在健株中到40天为止BjNIT1的表达量均处在较低水平;在40天时BjNIT1在病株中的表达量大约是在健株中表达量的50倍。在接种后10-30天间,BjNIT2在病株根部的表达量均低于健株,在20天时,差异达到最大;在40天时,两组中的BjNIT2的表达量几乎相等。从接种后至30天为止,BjNIT4在病株根部的表达量没有大的变化,而在40天时BjNIT4在病根中的表达量加倍。用RACE技术扩增腈水解酶基因cDNA全长,利用SMART,Expasy等在线软件分析推导的氨基酸序列的基本性质和蛋白质结构,并利用Clustalx软件构建进化树。结果表明所测得的745bp的BjNIT1序列包括390bp开放阅读框,79bp的5’非翻译区和276bp的3’非翻译区;696的BjNIT2序列包括390bp的开放阅读框,63bp的5’非翻译区和243bp的3’非翻译区;1026的BjNIT4序列包括825bp的开放阅读框,21bp的5’非翻译区和180bp的3’非翻译区。三个测得的腈水解酶序列均有加尾信号AATAAA和poly（A）尾巴。蛋白质功能位点和功能结构域分析表明,扩增的cDNA序列的5’端不完整。系统进化树显示茎瘤芥腈水解酶与同属植物芜菁的亲缘关系较近,其次是大白菜。本研究的结果显示,内参基因ACT、UBE和RPL2在茎瘤芥根中表达情况较为稳定,腈水解酶动态分析显示,BjNIT1的表达量受到根肿菌的诱导,以期为茎瘤芥根肿病致病机理的研究提供数据依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 绪论
• 1.1 研究背景及意义
• 1.1.1 研究背景
• 1.1.2 研究意义
• 1.2 根肿菌概况
• 1.2.1 根肿菌的生物学特性
• 1.2.2 根肿菌的生活史
• 1.2.3 根肿菌的传播途径和发病特点
• 1.3 根肿病相关的植物激素
• 1.3.1 生长素和细胞分裂素
• 1.3.2 腈水解酶简介
• 1.3.3 植物腈水解酶研究进展
• 1.4 研究目的和内容
• 1.4.1 研究目的
• 1.4.2 研究内容和技术路线
• 1.5 本研究的创新点
• 2 茎瘤芥被根肿菌侵染后腈水解酶基因的表达分析
• 2.1 引言
• 2.2 材料与仪器
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 主要仪器设备
• 2.2.3 MS 培养液的配制与主要试剂
• 2.3 实验方法与步骤
• 2.3.1 引物的设计与筛选
• 2.3.2 内参基因PCR 扩增条件的优化
• 2.3.3 内参基因和腈水解酶基因PCR 扩增产物验证
• 2.3.4 茎瘤芥根总RNA 的提取
• 2.3.5 DNase 酶处理及RNA 质量检测
• 2.3.6 cDNA 第一链的合成
• 2.3.7 qPCR
• 2.3.8 数据分析
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 引物的设计筛选
• 2.4.2 qPCR 退火温度的优化
• 2.4.3 PCR 扩增产物验证
• 2.4.4 总RNA 质量检测
• 2.4.5 内参基因的稳定性分析
• 2.4.6 腈水解酶基因的表达情况
• 2.5 本章小结
• 3 茎瘤芥 BJNIT 基因的末端序列克隆
• 3.1 引言
• 3.2 材料与仪器
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 主要仪器设备
• 3.2.3 主要试剂
• 3.3 实验方法与步骤
• 3.3.1 RACE 引物的设计及合成
• 3.3.2 3' RACE 法扩增BjNIT 基因的3'末端序列
• 3.3.3 3' RACE 产物克隆及阳性质粒的筛选和鉴定
• 3.3.4 3' RACE 产物的测序
• 3.3.5 5' RACE 法扩增BjNIT4 基因的5’末端序列
• 3.3.6 5' RACE 产物的克隆及阳性质粒的筛选和鉴定
• 3.3.7 5' RACE 产物的测序
• 3.3.8 生物信息学分析
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 推测氨基酸序列分析
• 3.4.2 腈水解酶基因编码的氨基酸的理化性质分析
• 3.4.3 腈水解酶功能位点分析
• 3.4.4 腈水解酶功能结构域分析
• 3.4.5 腈水解酶系统进化分析
• 3.5 本章小结
• 4 结论与讨论
• 4.1 内参基因的选取
• 4.2 腈水解酶基因的表达情况
• 4.3 腈水解酶进化分析
• 5 后续工作与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• A. 作者在攻读学位期间发表的论文目录
• B. 作者在攻读硕士学位期间参加的科研项目
• C. 用于表达分析的内参基因和腈水解酶基因的标准曲线