论文摘要
肺癌与其它实体肿瘤一样,生长和转移都需要依赖新生血管的形成,因而抗血管生成是当前治疗肺癌的重要策略之一。肿瘤细胞分泌的血管内皮生长因子（VEGF）在肿瘤血管生成过程中发挥关键作用,其促进肿瘤血管生成的功能主要由血管内皮细胞表面的两种膜受体-血管内皮生长因子受体-1（VEGFR-1）和血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2）介导,与其受体共同组成了促血管生成的信号转导系统,因此,阻断VEGF促血管生成的信号转导通路即是最重要最直接的抗肿瘤血管生成的靶向治疗。可溶性VEGF受体-1（sVEGFR-1）和可溶性VEGF受体-2（sVEGFR-2）与相应的膜受体有同等的VEGF亲和力而无信号转导功能,因而能阻断VEGF促血管生成的信号转导通路,抑制VEGF诱导血管生成的生物学效应。本研究构建人sVEGFR-1和sVEGFR-2基因重组真核表达载体,将其转染人肺腺癌A549细胞,观察sVEGFR-1和sVEGFR-2基因的表达及其生物学效应,比较单独和联合转染sVEGFR-1和sVEGFR-2基因抑制肺癌血管生成和肿瘤生长及转移的效果,并探讨其作用机制,为肺癌抗血管生成的基因治疗提供新的途径。方法1.利用RT-PCR法从人胎盘组织中扩增sVEGFR-1和sVEGFR-2基因编码区片段,并将其定向连接到真核表达载体pCMV-Script,分别构建成重组真核表达载体pCMV-Script-sVEGFR-1（命名为psR1）和pCMV-Script-sVEGFR-2（命名为psR2）。2.使用阳离子脂质体转染法将空载体和各重组真核表达载体转染A549细胞,共分为5组:⑴空载体pCMV-Script转染A549细胞组（命名为A549-pCMV组）;⑵重组载体psR1转染A549细胞组（命名为A549-psR1组）;⑶重组载体psR2转染A549细胞组（命名为A549-psR2组）;⑷psR1和psR2共转染A549细胞组（命名为A549-psR1R2组）;⑸未转染A549细胞组（命名为亲代A549组）。3.通过细胞培养和G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,传代培养后,再用RT-PCR、蛋白印迹分析（Western Blot）、免疫细胞化学、酶联免疫吸附试验（ELISA）鉴定各组转基因细胞及其培养上清液中目的基因的表达和分泌。4.通过细胞形态的观察、细胞计数及细胞生长曲线、MTT比色实验和流式细胞仪检测细胞周期,观察各载体转染对转基因A549细胞及其干预的脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖的影响。5.将各组A549细胞的培养上清液干预鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）,观察各组转基因A549细胞表达和分泌的sVEGFR-1和sVEGFR-2对鸡胚CAM血管生成的影响。6.建立裸鼠皮下移植瘤模型:将15只裸鼠随机分为5组,每组3只:⑴亲代A549组;⑵A549-pCMV组;⑶A549-psR1组;⑷A549-psR2组;⑸A549-psR1R2组。每组裸鼠背侧皮下接种相应组别的A549细胞。7.观察指标:⑴裸鼠的成瘤情况;⑵每周测量移植瘤的体积,观察移植瘤的增长速度;⑶肿瘤组织病理形态学观察;⑷免疫组化检测肿瘤的微血管密度（MVD）;⑸荷瘤裸鼠的生存时间及肿瘤转移情况。结果1.利用RT-PCR从人胎盘组织中成功扩增出sVEGFR-1和sVEGFR-2基因,其片段长度与预期大小一致。构建的重组真核表达载体psR1和psR2分别作双酶切和测序鉴定,证实其中含有sVEGFR-1和sVEGFR-2基因,测序结果经BLAST分析与预期的编码区序列一致,连接的方向正确。2.空载体和各重组载体转染的A549细胞,用G418筛选后均获得了稳定转染的细胞克隆;RT-PCR检测显示,A549-psR1组和A549-psR2组分别有sVEGFR-1 mRNA和sVEGFR-2 mRNA表达,而A549-psR1R2组表达这两种目的基因mRNA;Western Blot和免疫细胞化学检测显示,A549-psR1组和A549-psR2组分别有sVEGFR-1和sVEGFR-2蛋白表达,而A549-psR1R2组表达这两种目的蛋白;用ELISA法可从A549-psR1组和A549-psR2组细胞的培养上清液中检测到相应的目的蛋白,从A549-psR1R2组细胞的培养上清液中可检测到这两种目的蛋白;亲代A549细胞组和A549-pCMV组上述检测结果均为阴性。3.各载体稳定转染A549细胞的生长曲线、群体倍增时间、MTT结果、细胞周期与亲代A549细胞组比较没有显著性差异。但各组A549细胞干预的HUVEC培养结果与未干预组HUVEC培养结果比较,各重组载体转染A549细胞干预的HUVEC的生长速度减慢,群体倍增时间延长,MTT实验吸光度（A）值降低,细胞周期中G1期比例增高,S期比例降低。4.与未干预组CAM血管计数（12.33±1.53）比较,A549-psR1组和A549-psR2组培养上清液干预的CAM血管计数（分别为7.33±1.53和7.67±1.53）显著减少（P均<0.01）, A549-psR1R2组培养上清液干预的CAM血管计数（4.67±1.15）减少更为明显（P<0.01）,与A549-psR1和A549-psR2干预组比较,差异也有统计学意义（P<0.05）。5.建立的裸鼠皮下移植瘤模型,成瘤率为100%;裸鼠皮下成瘤后,可见每只裸鼠的肿瘤都稳定增长,体积逐渐增大,但各重组载体转染A549组的肿瘤增长速度明显比亲代A549组和空载体转染组慢,其中A549-psR1R2组肿瘤增长速度最慢。实验终点A549-psR1组、A549-psR2组和A549-psR1R2组的肿瘤体积（mm3）（分别为1338.3±78.8、1443.2±90.9和1171.5±40.8）显著小于亲代A549组（1620.0±27.8,P均<0.01）和A549-pCMV组（1626.7±10.4,P均<0.01）;A549-psR1R2组与A549-psR1组或A549-psR2组比较,差异也有统计学意义（P均<0.01）;但A549-pCMV组与亲代A549组肿瘤体积的差异没有统计学意义（P>0.05）。6.免疫组化分析显示,各组裸鼠移植瘤内均可见形态不规则,无明显管腔形成的微血管,但A549-psR1组、A549-psR2组和A549-psR1R2组的MVD（分别为15.8±2.6、18.6±2.3和10.8±1.3）显著低于亲代A549组（23.6±3.0,P均<0.01）和A549-pCMV组（25.2±1.3,P均<0.01）;A549-psR1R2组与A549-psR1组或A549-psR2组的肿瘤MVD比较,差异也有统计学意义（P均<0.01）;但A549-pCMV组与亲代A549组肿瘤MVD的差异没有统计学意义（P>0.05）。7.A549-psR1组、A549-psR2组和A549-psR1R2组荷瘤裸鼠的中位生存期（分别为68、74和79天）明显比亲代A549组（41天）和A549-pCMV组长（37天）（P均<0.01）。结论1.成功克隆了人sVEGFR-1和sVEGFR-2基因,将其转移到人肺腺癌A549细胞后在mRNA和蛋白水平上均能表达,并且表达的sVEGFR-1和sVEGFR-2能分泌到细胞外。2.sVEGFR-1和sVEGFR-2基因转移对转基因A549细胞自身的增殖没有明显的影响,但其表达的sVEGFR-1和sVEGFR-2能抑制体外培养的HUVEC的增殖,能抑制鸡胚尿囊绒毛膜新生血管的形成。3.sVEGFR-1和sVEGFR-2基因转移A549细胞后能抑制转基因细胞自身形成的裸鼠皮下移植瘤的生长及其瘤内血管生成。其抑制肿瘤生长的机制可能是通过旁分泌方式抑制瘤内血管生成实现的,而不是直接作用于肿瘤细胞。4.联合转染sVEGFR-1和sVEGFR-2基因具有增强抑制血管生成和肿瘤生长的作用。
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