论文摘要
前期工作证实Scirr69（spinal cord injury regeneration related gene No.69）是具有转录激活活性的新基因（GenBank accession #AY546001）,该基因编码蛋白（521aa）结构特点与CREB/ATF转录因子家族成员高度相似。本研究是对上述工作的继续和深入。染色质免疫沉淀（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）结合PCR方法发现原代神经细胞内SCIRR69能与BDNF（Brain-Derived Neurotrophic Factor）promoterⅡ特异性结合。同样条件却未检测出SCIRR69与Bip及BDNF其它启动子形成复合物。相对荧光素酶活性检测进一步确认了SCIRR69与BDNF promoterⅡ之间的相互作用,排除SCIRR69与BDNF其它promoter之间的结合。通过比较SCIRR69全长及各C端缺失突变体与BDNF promoterⅡ相互作用后起始报告基因表达情况,发现SCIRR69（△379-521）突变体对BDNF promoterⅡ的转录激活作用最强。PC12细胞过表达SCIRR69后经55mM KCl作用BDNF出现明显高调。当siRNA沉默SCIRR69基因后,BDNF表达也呈现相应下调。明确SCIRR69作为BDNF转录激活子通过KCl调节BDNF表达。利用重叠延伸PCR方法对BDNF promoterⅡ进行系列缺失突变。比较各突变体相对荧光素酶活性确定BDNF promoterⅡ上SCIRR69反应元件（SCIRR69-responsive element,SRE）为5’-GCACTTCA-3’。将包含SRE的56bp序列作为探针,并进行5’端生物素标记后与表达SCIRR69的细胞核提取物反应,EMSA结果显示,SCIRR69经55mM KCl作用后入核的活性形式能与探针中SRE位点特异性结合,进一步证实BDNF promoterⅡ中的SCIRR69反应元件为5’-GCACTTCA-3’。过表达SCIRR69全长（FL）及不同C末端截短型突变体,比较PC12细胞BDNF表达情况,发现SCIRR69 C末端截短型突变体均能促进BDNF表达上调,尤以SCIRR69（△379-521）突变体作用明显,该结果证实了前述的各C末端截短型突变体相对荧光素活性结果,说明SCIRR69（△379-521）可能为SCIRR69从内质网切割后入核发挥转录激活作用的活性形式。收集表达SCIRR69（△379-521）突变体的PC12细胞培养液上清对皮层组织块进行条件培养,具有比BDNF（12.5ng/ml）更为强大的促神经再生功能。N端融合表达Flag tag SCIRR69经rabbit anti-Fiag IP,mouse anti-SCIRR69Western blotting。结果显示除80KD及分子量略小于80KD条带外,还存在两条约50KD和52KD条带。当表达SCIRR69细胞经蛋白酶S1P抑制剂AEBSF作用后,52KD条带消失,说明SCIRR69能被蛋白酶S1P识别并切割。通过突变分析确定RNLL（427aa～430aa）为S1P在SCIRR69上的识别位点,Glutamine（396）为蛋白酶S2P识别位点。EMSA证实经S2P切割后释出的SCIRR69 N端片段是入核发挥转录激活作用的活性形式。