l32基因的敲除和过表达菌株的构建及其生长特性研究

论文摘要

核糖体蛋白L32（ribosome protein L32）是一种在动物、植物和酵母等不同生物类群中普遍存在的蛋白,其进化上相对保守。大多数真核生物的核糖体蛋白L32仅由一个基因编码,而粟酒裂殖酵母核糖体蛋白L32由两个基因编码,表达的蛋白质分别是L32-1和L32-2。本实验室前期已对132-2基因进行了克隆表达,并对其功能进行了研究,表明其可能是一种潜在的转录调控因子。由于核糖体蛋白L32-1和L32-2的氨基酸序列相似度极高,为96.85%,为了更深入地研究和确定粟酒裂殖酵母核糖体蛋白L32-1和L32-2的功能,本文首先构建了132基因的敲除和过表达酵母菌株,并对这些菌株的生长特性进行了研究。本文首先提取了野生型粟酒裂殖酵母Sohizosacchharomyces pombe的基因组DNA,通过PCR反应扩增得到编码核糖体蛋白L32-1的基因132-1,将其连接到pMD18-T载体上,用双酶切连接的方法将其连入酵母表达载体pESP-3,构建质粒pESP-3/ι32-1,醋酸锂法转化SP-QO1菌株,构建过表达菌株SP-QO1（pESP-3/ι32-1）.另外,本实验室前期研究中已成功构建过表达菌株SP-Q01（pESP-3/ι32-2）.本文还成功构建了敲除132基因的酵母菌株。通过设计三对引物,两轮over-lapPCR反应获得含有132基因上下游同源臂的融合片段,将其导入SP-Q01菌株,通过同源置换原理,G418抗性筛选,最终成功构建了敲除菌株SP-Q01（Δι32-1）和SP-Q0l（△132-2）的突变株。同时,在敲除菌的基础上,我们回补了相关基因,得到了基因回补菌株SP-Q01（Δι32-1,pESP-3/ι32-1）.SP-Q01（Δι32-1,pESP-3/ι32-2）.SP-Q01 （△ι32-2,pESP-3/ι32-1）.SP-Q01（△ι32-2,pESP-3/ι32-2）。最后,本文对132基因的敲除或过表达菌株的生长特性进行了研究。测定其生长曲线发现,132-1基因的过表达菌株的生长速度最慢；形态观察发现,敲除132基因的酵母菌株SP-Q01（△ι32-1）和SP-Q01（△ι32-2）出现凝絮现象,过表达132基因的菌株SP-Q01（pESP-3/ι32-1）和SP-Q01（pESP-3/ι32-2）出现了个体形态变长的细胞。具体的机制有待继续研究探讨。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1 核糖体蛋白研究进展
• 2 功能基因研究进展
• 3 基因过表达技术
• 4 基因敲除技术与基因回补实验
• 5 本论文研究目的及意义
• 第二章 过表达核糖体蛋白l32-1基因的酵母菌株SP-Q01（pESP-3/l32-1）的构建
• 第一节 粟酒裂殖酵母核糖体蛋白L32-1基因的克隆
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二节 酵母表达质粒PESP-3/L32-1的构建
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三节 过表达核糖体蛋白L32-1基因的酵母菌株SP-Q01（PESP-3/L32-1）的构建
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三章 敲除l32基因的酵母菌株SP-Q01（△l32-1）、SP-Q01（△l32-2）及其基因回补菌株的构建
• 第一节 敲除L32-1基因的酵母菌株SP-Q01（△L32-1）构建
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二节 敲除L32-2基因的酵母菌株SP-Q01（△L32-2）构建
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三节 基因回补菌株SP-Q01（△L32-1,PESP-3/L32-1）、SP-Q01（AL32-1,PESP-3/L32-2）、SP-Q01（△L32-2,PESP-3/L32-1）、SP-Q01（△L32-2,PESP-3/L32-2）的构建
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第四节 对照空载质粒菌株构建
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第四章 l32基因的敲除或过表达菌株的生长特性研究
• 第一节 L32基因的敲除或过表达菌株的生长曲线测定
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二节 L32基因的敲除或过表达菌株的形态观察
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 总结与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢