藏药红景天中查尔酮合成酶基因的克隆与分析

论文摘要

红景天是传统的常用中药之一,具有重要的药用价值,其中黄酮类化合物是红景天中的主要有效成份。近年来对黄酮类化合物的研究,特别是如何提高药用植物中黄酮的含量已经成为研究的热点与难点。对于提高黄酮的相对百分含量的研究,前人已有大量的报道,事实证明采用生理生化途径调控黄酮相对百分含量是一种有效的方法。同时,利用植物基因工程技术对植物进行遗传改良或在分子水平上调控植物黄酮合成途径中关键酶的活性,从而提高黄酮含量也是一种行之有效的方法。黄酮的合成代谢中涉及到十几种酶,而查尔酮合成酶（chalcone synthase,CHS）是红景天黄酮合成代谢途径中的关键酶。因而,开展红景天查尔酮合成酶的研究具有重要的理论意义与实践价值。本研究以此为基础,以长鞭红景天为实验材料,采用改进的CTAB法提取DNA和RNA。利用RT-PCR技术提取出cDNA,利用一对简并引物分离出查尔酮合成酶基因的部分序列,采用单侧寡聚核苷酸嵌套PCR（single oligonucleotide nested PCR,SON-PCR）方法从红景天中分离出查尔酮合成酶基因的DNA全长序列。再利用组织培养得到的红景天进行黄酮含量测定,得到的主要结果如下:1.采用实验室改进的CTAB法提取红景天的DNA和RNA,提取的DNA经电泳检测,有清晰的主带,说明提取的DNA质量较好。抽提的RNA经紫外吸收测量,A260/A280接近2.0;反转录合成的cDNA经引物扩增,出现清晰的条带,说明提取的RNA与DNA的纯度高,质量好。该法简便易行,适合于富含多糖,多酚植物材料的核酸提取。2.采用1对简并引物,以红景天DNA为模板进行PCR扩增,得到了860 bp的CHS的基因片段,GenBank登录号为:EF070214。3.利用SON-PCR技术首次从红景天中分离出黄酮合成代谢的第一个关键酶基因CHS基因,命名为Rhchs,其序列全长为2 443 bp,包括682 bp的启动子区、1 143 bp的编码区和3’UTR区。预测序列编码381个氨基酸,其氨基酸组成与其他已知的高等植物的查尔酮合成酶具有很高的同源性,与葡萄、山茶花、杜鹃和牵牛的同源性分别为87 %、87 %、86 %、85 %,且大部分氨基酸序列保守。4.将本研究获得的查尔酮合成酶基因的保守序列与另外10个物种的序列进行比对与聚类分析,结果发现11个物种共分为3个相似类群,其中同属于单子叶植物的构成了一个分支,属于十字花科的植物构成另一个分支;长春花、柑橘、胡桃和杜鹃花构成一个类群;而红景天和覆盆子构成一个分支,可以推定红景天查尔酮合成酶与此物种具有较高的相似性。5.红景天查尔酮合成酶基因（Rhchs）的组织结构分析显示由2个外显子和1个内含子组成,起始密码子（ATG）和终止密码子（TAA）分别位于第1个外显子和第2个外显子内。且第二个外显子比第一个外显子更长更保守。6.根据红景天查尔酮合成酶基因（Rhchs）序列,成功构建了Rhchs基因的原核表达载体pZP211:Rhchs。7.对红景天进行黄酮含量的测定,测定结果表明:单位质量红景天中含有总黄酮量为:4.6 mg/g。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 绪论
• 1.1 红景天属植物概述
• 1.1.1 红景天属植物的药用历史
• 1.1.2 红景天属植物的生态学研究
• 1.1.3 红景天属植物的分类
• 1.1.4 红景天属植物的化学成分和药理作用研究
• 1.1.5 红景天的应用概况
• 1.1.6 红景天濒危原因的分析
• 1.2 黄酮类化合物代谢工程研究进展
• 1.2.1 黄酮类化合物的结构及类别
• 1.2.2 黄酮类化合物的生物功能和鉴定分析
• 1.2.3 黄酮类化合物的生物合成基本途径
• 1.3 植物CHS 研究现状
• 1.3.1 CHS 分子生物学研究
• 1.3.2 CHS 与植物生理代谢
• 1.4 立题依据和主要内容
• 第二章 实验材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 红景天总DNA 的提取
• 2.2.1 总DNA 的提取方法
• 2.2.2 DNA 的检测及稀释
• 2.2.3 RNA 的提取
• 2.3 CHS 基因的克隆及测序
• 2.3.1 引物的设计与合成
• 2.3.2 红景天CHS 基因保守区域的PCR 扩增
• 2.3.3 RT-PCR 扩增
• 2.3.4 SON－PCR 法扩增全长
• 2.3.5 cDNA 的PCR 扩增
• 2.3.6 PCR 扩增片段回收、克隆及测序
• 2.4 表达载体的构建
• 2.5 红景天的组织培养
• 2.5.1 培养条件
• 2.5.2 愈伤组织的诱导
• 2.5.3 愈伤组织的分化
• 2.6 总黄酮的含量测定
• 2.6.1 仪器与试药
• 第三章 结果和分析
• 3.1 CHS 基因的保守区PCR 扩增
• 3.2 CHS 基因的SON－PCR 全长扩增
• 3.2.1 CHS 基因5’端的扩增
• 3.2.2 CHS 基因3’端的扩增
• 3.3 红景天基因DNA 全序列分析
• 3.4 cDNA 的扩增
• 3.5 序列对比与系统树分析
• 3.6 红景天的组织培养
• 3.7 总黄酮的含量测定
• 3.7.1 芦丁标准曲线的制备
• 3.7.2 仪器精密度测量
• 3.7.3 样品的测定
• 3.7.4 稳定性
• 3.8 表达载体的构建与鉴定
• 第四章 讨论
• 4.1 多糖类及多酚类药用植物DNA 和RNA 的提取
• 4.2 染色体步移及SON－PCR 技术
• 4.3 红景天CHS 基因的克隆
• 4.4 克隆CHS 基因的意义
• 4.5 红景天CHS 基因表达与黄酮的积累
• 4.6 未来的工作及工作展望
• 致谢
• 参考文献
• 硕士期间取得的研究成果