论文摘要
GADD45（growth arrest and DNA damage-inducible gene 45）α属于生长抑制及DNA损伤诱导基因家族的一员,紫外线（ultraviolet, UV）照射、甲基甲磺酸（methylmethanesulfonate, MMS）及电离辐射（ionizingradiation, IR）等多种DNA损伤因素可迅速诱导GADD45α表达,并发挥细胞周期行进抑制、DNA损伤修复、诱发衰老及促细胞凋亡等多种生物学功能。鉴于以上性质, GADD45α被认为具有肿瘤抑制因子的潜能。但随着近年来一些全新研究结果的发现,GADD45α在肿瘤抑制反应中的作用受到争议和质疑。有文献报道证实,GADD45α在某些外界刺激条件下的诱导表达能够发挥抗肿瘤细胞凋亡效应;而且一些临床实验结果亦表明,GADD45α可在某些肿瘤组织中高表达,并与肿瘤细胞失去化疗敏感性和病人低生存率直接相关。因此,GADD45α在肿瘤细胞生存与凋亡反应中的作用及机制仍有待进一步阐明。本研究以肝癌细胞HepG2为模型,以在血液系统肿瘤的临床治疗中已取得满意疗效的肿瘤抑制药物三氧化二砷（As2O3）为刺激源,研究了GADD45α在As2O3诱导肝癌细胞凋亡反应中的作用及分子机制。在第一部分研究中发现:As2O3能够诱导HepG2细胞发生细胞凋亡反应,并同时诱导GADD45α高强度持续性表达。而当GADD45α的诱导表达被抑制后,As2O3的促细胞凋亡效应即明显减弱,表明GADD45α是介导As2O3诱导HepG2细胞凋亡反应的关键信号蛋白分子。进一步研究发现, JNK/AP-1通路是位于GADD45α下游传递As2O3促细胞凋亡效应的重要信号途径,c-Jun和Fra-1是组成As2O3诱导活化的AP-1的功能亚基。在正常人二倍体肝细胞HL7702中未发现As2O3刺激作用下GADD45α/JNK/AP-1通路的明显活化,而且HL7702细胞对As2O3的刺激敏感性远远低于HepG2细胞。以上结果证明, GADD45α/JNK/AP-1途径是介导As2O3特异性诱导肝癌细胞凋亡反应的重要信号通路。GADD45α是至今为止发现的表达调控最为复杂的细胞应激反应蛋白之一,除在转录水平上受p53等转录因子的调节外,GADD45α的诱导表达在转录后水平、翻译水平和翻译后水平也受到多层次的调控。本课题组在近期工作中,首次发现在正常二倍体细胞中存在一种与泛素化修饰反应相关的GADD45α翻译后诱导表达调控机制。因此,在阐明GADD45α诱导表达介导HepG2细胞凋亡效应的下游信号转导途径的基础上,我们在第二部分研究中又进一步探讨了As2O3诱导GADD45α表达的上游调控机制。结果发现,在HepG2细胞中同样存在GADD45α的组成性泛素化修饰和蛋白质降解反应,从而使静息细胞中GADD45α维持于极低水平表达。As2O3的刺激作用能够通过上调GADD45α的蛋白稳定性,导致其在蛋白水平的大量迅速聚集,此过程中不涉及GADD45α的转录调控。为揭示HepG2细胞中GADD45α蛋白稳定性的调控机制,我们借助于计算机辅助下的分子模拟,预测了GADD45α分子表面与其它信号调控分子（包括E3泛素连接酶）发生相互作用的区域,并据此构建了一系列GADD45α突变体,同时对这些突变体与野生型GADD45α的稳定性差异进行了详细分析。我们发现,GADD45α分子中含有两个与其蛋白稳定性调控密切相关的结构区域,这两个区域突变后可导致GADD45α的蛋白稳定性明显增加。随后,我们又通过酵母双杂交实验,筛选可能参与调控GADD45α蛋白稳定性的功能蛋白,希望以此为突破口鉴定调控GADD45α泛素化修饰反应的E3泛素连接酶。结果显示,核糖体小亚基蛋白S7能够下调GADD45α的组成性泛素化修饰反应,提高其稳定性并介导As2O3刺激作用下GADD45α的诱导表达。尽管S7并不具备E3泛素连接酶的性质,但通过研究S7调控的泛素化调节蛋白（例如MDM2）将可能为揭示GADD45α的泛素化修饰反应和蛋白稳定性的调控机制提供重要的研究基础。IKK/NF-κB途径是调控应激损伤反应中细胞生存与凋亡的关键信号通路。本课题组在以往研究中发现,GADD45α在正常二倍体细胞中介导的细胞凋亡反应与介导NF-κB活化的上游蛋白激酶IKKα和IKKβ的功能密切相关。因此,在第三部分研究中,我们还观察了IKK激酶在As2O3诱导细胞凋亡反应中的作用。我们发现,As2O3诱导的细胞凋亡反应中伴有IKKα和IKKβ蛋白表达水平下调。进一步的研究发现,这种现象在肿瘤细胞以及肿瘤抑制药物反应中普遍存在,且IKKα和IKKβ表达水平下调与NF-κB在As2O3刺激作用下的诱导活化状态无关。在对IKKα和IKKβ蛋白表达水平下调机制的研究中发现,IKKβ表达水平下调源于转录抑制,而IKKα表达水平下调发生于翻译后水平并受与溶酶体蛋白降解途径相关机制所调控。综上所述,本论文研究结果揭示了GADD45α介导As2O3特异性诱导肝癌细胞凋亡反应中的信号转导通路,同时确定了GADD45α分子中与其蛋白稳定性调控相关的一级结构特征以及调控其蛋白稳定性的功能蛋白的初步作用模式。这些研究结果为进一步阐明GADD45α在肿瘤药物反应中的效应机制奠定了基础。
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