约克氏菌WZY002在α,β-不饱和醇制备中的应用及其醇脱氢酶的纯化与表征

论文摘要

α,β-不饱和醇是合成香料、香精、原料药等的重要中间体。α,β-不饱和醇的制备主要是通过化学催化剂催化加氢还原α,p-不饱和醛、酮来获得,然而该还原反应的位点选择性较低,并且需要昂贵的金属催化剂。与之相比,生物催化剂由于其天然的位点专一性已越来越受关注。本研究从土壤样品中筛选获得一株催化性能优良的菌株一约克氏菌（Yokenella sp.）WZY002,该菌能选择性还原α,β-不饱和醛、酮得到相应的不饱和醇。在此基础上,对其对应的醇脱氢酶进行了分离纯化,并且完成了酶学性质表征。此外,克隆该醇脱氢酶的编码基因,并在大肠杆菌中成功实现了功能性表达。1.本研究从土壤中筛选获得一株高效的生物催化剂,结合形态、生理生化和16S rDNA分子鉴定等信息,将其命名为Yokenella sp.WZY002。该菌能高效地还原α,β-不饱和醛、酮位点生成α,β-不饱和醇,该反应具有良好的位点选择性。该菌催化还原反应的最适温度和pH分别为30℃和pH 8.0。葡萄糖作为辅助底物能提高还原反应的转化率和得率,反应不需添加辅酶NADP（H）。以50mM的巴豆醛、反-2-己烯醛和苯甲醛等为底物时,该菌催化反应的转化率均大于98%,而且不饱和醇的得率均大于85%。另外,该菌还原2-羟基苯乙酮中生成（S）-型的1,2-二羟基苯乙醇,其产物e.e.值大于99%。该菌能耐受较高浓度的底物,在400mM的巴豆醛为底物时仍然具有催化活力。2.利用离子交换层析、疏水层析及凝胶过滤层析从Yokenella sp.WZY002中纯化得到一个醇脱氢酶,该酶能催化不饱和醛、酮还原生成不饱和醇。纯酶的比活力为25.9U/mg,其亚基大小为37±1kDa。酶催化还原反应的最适温度和pH分别为30℃和pH 7.5。1mM的Na+、Ca2+、Mg2+和K+对酶活力的影响不明显,而1mM的Zn2+、Mn2+和Al3+显著地抑制酶活力。该醇脱氢酶能耐受较高浓度的有机溶剂,20%的乙腈、乙醇、甲醇及丙酮等使相对酶活力提高到142.3-155.8%。虽然40%的甲醇及丙酮不同程度抑制了酶的活力,但其保留活力均大于初始酶活力的85%。Yokenella sp.WZY002醇脱氢酶是严格依赖NADP（H）。当0.4mM NADPH为辅酶时,该酶对苯甲醛的表观Km值和Vmax值分别为0.12mM和35.3U/mg。3.从约克氏菌WZY002基因组DNA中克隆出了编码上述醇脱氢酶的基因,该基因编码339个氨基酸残基。基因信息表明该酶属于中链醇脱氢酶家族成员,其活性中心及辅酶结合位点保守序列分别为G62H63E64X2G67X5G73和G175XG177XXG120。三维结构模拟结果显示其三级结构是由两部分组成,一是含有典型‘"Rossmann"折叠的二核苷酸结合域,另一个是底物结合域。该酶的单体含有两个Zn2+,催化Zn2+位于活性位点附近,而结构Zn2+则处于底物结合域的角落。另外,我们成功地实现了该基因在大肠杆菌中的功能性表达。基因重组菌经诱导破碎后,粗酶比活力为2.1U/mg。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 α,β-不饱和醇的应用
• 1.1.1 脂肪族α,β-不饱和醇的应用
• 1.1.2 芳香族α,β-不饱和醇的应用
• 1.1.3 其他类α,β-不饱和醇的应用
• 1.2 α,β-不饱和醇的制备
• 1.2.1 化学法制备α,β-不饱和醇
• 1.2.2 生物法制备α,β-不饱和醇
• 1.3 醇脱氢酶及其在α,β-不饱和醇的制备中的应用
• 1.3.1 醇脱氢酶的分类与结构特点
• 1.3.2 醇脱氢酶在α,β-不饱和醇的制备中的应用
• 1.4 本论文研究背景、内容及意义
• 参考文献
• 第二章 约克氏菌WZY002及其在微生物催化制备α,β-不饱和醇中的应用
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 缓冲液
• 2.2.4 试剂与材料
• 2.2.5 主要仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.0 菌种筛选
• 2.3.1 菌种发酵培养
• 2.3.2 菌种鉴定
• 2.3.2.1 镜检
• 2.3.2.2 分子鉴定
• 2.3.2.3 生理生化鉴定
• 2.3.3 α,β-不饱和醛、酮的位点选择性还原
• 2.3.3.1 辅底物对巴豆醛的位点选择性还原的影响
• 2.3.3.2 辅底物浓度对巴豆醛的位点选择性还原的影响
• 2.3.3.3 温度、pH对巴豆醛的位点选择性还原的影响
• 2.3.4 气相色谱分析
• 2.3.5 气相-质谱联用分析
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 菌种鉴定结果
• 2.4.1.1 基本菌落特征
• 2.4.1.2 电镜下形态特征
• 2.4.1.3 生理生化鉴定
• 2.4.1.4 菌株WZY002分子鉴定
• 2.4.2 α,β-不饱和醛、酮位点选择性还原最适反应条件
• 2.4.2.1 辅底物对位点选择性还原反应的影响
• 2.4.2.2 辅底物浓度对位点选择性还原反应的影响
• 2.4.2.3 温度、pH对位点选择性还原反应的影响
• 2.4.3 α,β-不饱和醛、酮的位点选择性还原
• 2.4.4 芳香族不饱和醛、酮的还原
• 2.4.5 底物浓度对位点选择性还原的影响
• 2.5 本章小结与讨论
• 参考文献
• 第三章 约克氏菌WZY002醇脱氢酶的纯化与表征
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 缓冲液
• 3.2.4 试剂与材料
• 3.2.5 主要仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 菌种培养
• 3.3.2 醇脱氢酶的分离
• 3.3.2.1 粗酶液的制备
• 3.3.2.2 离子交换柱层析
• 3.3.2.3 疏水柱层析
• 3.3.2.4 凝胶过滤层析
• 3.3.3 蛋白质浓度及酶活力测定
• 3.3.4 蛋白质分子量测定
• 3.3.5 醇脱氢酶的活性染色
• 3.3.6 蛋白质电转膜及N-端序列测定
• 3.3.7 醇脱氢酶酶学性质研究
• 3.3.7.1 酶促反应最适温度和pH
• 3.3.7.2 醇脱氢酶的底物特异性
• 3.3.7.3 有机溶剂、金属离子及EDTA对醇脱氢酶活力影响
• 3.3.7.5 酶动力学参数
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 醇脱氢酶的分离、纯化
• 3.4.2 醇脱氢酶的活性染色
• 3.4.3 醇脱氢酶电转膜及N-端序列测定
• 3.4.4 醇脱氢酶酶学性质研究
• 3.4.4.1 温度及pH对Yokenella sp.WZY002醇脱氢酶活力影响
• 3.4.4.2 金属离子及EDTA对Yokenella sp.WZY002醇脱氢酶活力影响
• 3.4.4.3 有机溶剂对Yokenella sp.WZY002醇脱氢酶活力影响
• 3.4.4.4 Yokenella sp.WZY002醇脱氢酶底物特异性
• 3.4.4.5 Yokenella sp.WZY002醇脱氢酶动力学参数
• 3.5 本章小结与讨论
• 参考文献
• 第四章 约克氏菌WZY002醇脱氢酶克隆、表达及结构分析
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 菌种及质粒载体
• 4.2.3 缓冲液
• 4.2.4 试剂
• 4.2.5 主要仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 菌种培养
• 4.3.2 基因组及质粒组提取
• 4.3.3 引物设计
• 4.3.4 Yokenella sp.WZY002醇脱氢酶基因PCR扩增
• 4.3.5 目的基因链接及重组质粒转化
• 4.3.6 重组酶的诱导表达
• 4.3.7 重组Yokenella sp.WZY002醇脱氢酶的序列分析及同源建模
• 4.4 实验结果
• 4.4.1 基因组提取及目的基因PCR扩增
• 4.4.2 重组蛋白的诱导表达及活力测定
• 4.4.3 重组醇脱氢酶的结构分析
• 4.5 本章小结与讨论
• 参考文献
• 第五章 总结与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 致谢