HrpZpsta基因表达载体的构建及在大豆中的遗传转化

论文摘要

大豆是我国重要的经济粮食作物,是保障人民正常生活的基本资料。大豆疫霉根腐病是一种对大豆生产造成极大的威胁的土传性疾病,又有明显的扩散趋势。如何面对大豆疫霉根腐病的危机,保障大豆生产的正常进行,减少大豆疫霉根腐病对大豆生产的危害,是每一个科学工作者所必须面对的难题。利用传统育种方式和转基因育种方式均可以从根本上提高大豆种质资源的品质,但由于传统育种方式存在许多缺陷,利用转基因育种技术创新大豆种质资源已是大势所趋。Hrp基因家族中的hrpZpsta基因可以编码happin蛋白,此种蛋白可以引起高等植物本身的过敏反应（称为HR反应）。HR反应可以使植物本身获得对病虫害的广谱抗性,提高大豆品种的抗病虫性,促进大豆产业进一步的发展。本实验利用基因工程技术,将目的基因hrpZpsta导入大豆中,构建含有hrpZpsta基因的植物表达载体,以期获得具有疫霉根腐病的抗性转基因阳性植株。主要实验步骤如下：根据GenBank上hrpZpsta基因的序列,设计一对特异性的引物,并在两端加入适宜的酶切位点,以克隆载体pMD18-T-hrpZpsta为模板,PCR扩增Hrp基因家族中存在于烟草野火病原菌中一段长度为423bp的hrpZpsta基因片段。将获得的目的片段与植物表达载体pBI121同步进行双酶切处理。利用T4连接酶将酶切后回收的目的基因和植物表达载体在22℃的条件下进行连接。将重组表达载体转化到农杆菌感受态细胞EHA105中。利用农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化法和花粉管通道法将目的基因hrpZpsta导入到大豆植株中。对再生的大豆植株进行PCR、Southern杂交、RT-PCR和SDS-PAGE检测。主要实验结果如下：成功的构建了重组植物表达载体pBI121-hrpZpsta。确定了筛选培养基中卡那霉素的最佳筛选浓度为100mg/L。通过农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化法获得了83株T0、T1代再生植株；通过花粉管通道法获得了178株T1、T2代再生植株。对获得再生代植株进行PCR、Southern杂交、RT-PCR和SDS-PAGE检测。结果发现有14株农杆菌介导法的再生植株和5株花粉管通道法的再生植株检测结果为阳性。初步证明了hrpZpsta基因已成功转入大豆基因组中,转化率分别为15.6%和2.8%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 大豆研究概述
• 1.2 大豆疫霉根腐病研究概述
• 1.2.1 大豆疫霉根腐病的危害
• 1.2.2 大豆疫霉根腐病的防治措施
• 1.3 hrp基因研究概述
• 1.3.1 基因调控功能
• 1.3.2 蛋白质转位泌出功能
• 1.3.3 Hrp基因与avr基因的关系
• 1.3.4 编码HR反应激发子
• 1.3.5 Hrp基因参与纤毛的形成
• 1.3.6 Harpin蛋白的结构与特点
• 1.3.7 Harpin蛋白作用机理
• 1.3.8 Harpin蛋白的应用
• 1.4 大豆遗传转化
• 1.4.1 大豆遗传转化方法-农杆菌介导法
• 1.4.2 基因枪法
• 1.4.3 电激法
• 1.4.4 PEG电激法
• 1.4.5 超声波辅助农杆菌介导法
• 1.4.6 显微注射法
• 1.4.7 花粉管通道法
• 1.5 转化受体要求
• 1.5.1 受体材料的选择
• 1.5.2 大豆遗传转化中常用受体
• 1.6 本课题研究的目的与意义
• 1.6.1 研究目的
• 1.6.2 研究意义
• 第二章 HrpZpsta基因重组植物表达载体的构建
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌株与载体
• 2.1.2 酶和试剂
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 克隆载体质粒的提取
• 2.2.3 HrpZpsta基因的扩增
• 2.2.4 PCR扩增产物的检测及回收
• 2.2.5 重组植物表达载体pBI121-hrpZpsta的构建
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 重组植物表达载体pBI121-hrpZpsta的构建
• 2.3.2 HrpZpsta基因的测序及序列分析
• 第三章 重组植物表达载体的遗传转化及转基因植株的检测
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 试剂与主要仪器设备
• 3.1.3 培养基
• 3.2 农杆菌介导的大豆遗传转化
• 3.2.1 农杆菌感受态的制备
• 3.2.2 重组表达载体转化农杆菌感受态
• 3.2.3 转化子的筛选
• 3.2.4 农杆菌工程菌液的制备
• 3.2.5 大豆子叶节的培养和处理
• 3.2.6 大豆子叶节卡那霉素选择压的确定
• 3.2.7 农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化
• 3.3 大豆花粉管通道法的遗传转化
• 3.3.1 植物材料的准备
• 3.3.2 质粒DNA的提取和纯化
• 3.3.3 大豆花粉管通道法的遗传转化的方法
• 3.4 转基因植株的检测
• 3.4.1 转基因植株的PCR检测
• 3.4.2 转基因植株的Southern杂交检测
• 3.4.3 转基因植株的RT-PCR检测
• 3.4.4 转基因植株的SDS-PAGE检测
• 3.5 结果与分析
• 3.5.1 农杆菌工程菌的获得
• 3.5.2 大豆子叶节卡那霉素选择压的确定
• 3.5.3 农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化
• 3.5.4 大豆花粉管通道的遗传转化
• 0代转基因植株的PCR检测'>3.5.5 农杆菌介导法获得的T₀代转基因植株的PCR检测
• 3.5.6 转基因品系的PCR检测
• 1代转基因植株的Southern杂交'>3.5.7 农杆菌介导的大豆遗传转化获得的T₁代转基因植株的Southern杂交
• 3.5.8 转基因品系的RT-PCR检测
• 3.5.9 转基因品系的SDS-PAGE检测
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介