菊花CVB、TAV和CChMVd病毒的RT-PCR检测及匍匐小菊叶盘再生体系的建立

论文摘要

危害菊花的病毒种类很多,已报道的有20余种,我国初步鉴定出7种。对于我国来说,相当一部分的菊花病毒病都属于检疫性病害。因此菊花病毒检测方法的研究,对我国菊花产业的发展具有重要意义。匍匐小菊是通过抗逆性强的野生小菊与分枝性强且生长速度快的野生小菊杂交而育成的新种,该种植株低矮,生长速度快,是极好绿化材料。为了能够使用转基因技术对匍匐小菊进行改良,建立其组织培养再生系统是必要的。本研究以四个菊花品种为材料,研究了PT-PCR检测CVB、TAV、CChMVd的技术;以匍匐小菊为材料,建立匍匐小菊的叶盘再生体系。取得以下研究结果:1.利用CVB、TAV、CChMVd的已知基因序列设计引物,对这三种病毒进行了RT-PCR检测,建立了RT-PCR检测技术体系,并克隆了特异扩增产物,测序结果与已报道的基因序列进行核苷酸同源性分析。RT-PCR得到的CVB基因的部分片段,长633bp,该序列与已发表的序列同源性在82%左右。RT-PCR得到的TAV基因的部分片段,长842bp,该序列与已发表的序列同源性在98%左右。CChMVd是一种类病毒,通过RT-PCR得到的片段,长217bp,该序列与已发表的序列同源性在98%以上。2.以CChMVd为材料测试RT-PCR的灵敏度,结果表日月,PCR体系中含有fg级病毒RNA,反转录后,可以检测出来。3.建立了菊花B病毒（CVB）和番茄不孕病毒（TAV）两重RT-PCR检测体系,检测效果与普通RT-PCR相同。4.利用得到的TAV CP的全基因,做原核表达,产生28kD的CP蛋白,可用于制作抗血清。5.建立了匍匐小菊的叶盘再生体系。以MS为基本培养基添加NAA和6-BA这两种激素,建立无菌苗的培养基为MS+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA;生根培养基为1/2MS+0.1 mg/L NAA,一周左右就开始生根,生根率为100%;叶盘再生培养基为MS+0.1 mg/LNAA+0.5 mg/L 6-BA,芽诱导率为96%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 第一章 文献综述
• 1 菊花主要病毒的主要特性
• 1.1 菊花B病毒
• 1.2 番茄不孕病毒
• 1.3 菊花枯黄斑点类病毒
• 1.4 菊花矮化类病毒
• 1.5 黄瓜花叶病毒
• 1.6 番茄斑驳萎蔫病毒
• 1.7 烟草花叶病毒
• 2 病毒检测方法
• 2.1 生物学检测
• 2.2 血清学检测
• 2.2.1 酶联免疫吸附测定
• 2.2.2 点免疫结合测试技术
• 2.2.3 直接组织斑免疫测定法
• 2.2.4 电印迹免疫分析法
• 2.2.5 伏安酶联免疫法
• 2.2.6 快速免疫滤纸测定法
• 2.2.7 胶体金免疫层析试验
• 2.2.8 免疫毛细区带电泳
• 2.3 分子生物学检测
• 2.3.1 多聚酶链式反应
• 2.3.2 多重RT-PCR
• 2.3.3 荧光实时PCR
• 2.3.4 核酸杂交技术
• 2.3.5 双链RNA
• 2.3.6 基因芯片技术
• 2.4 类病毒的检测方法研究
• 2.4.1 生物学检测
• 2.4.2 电泳方法
• 2.4.3 RT-PCR
• 2.4.4 核酸杂交技术
• 2.4.5 RT-PCR-ELISA方法检测类病毒
• 2.5 菊花病毒检测技术研究
• 3 研究的目的与意义
• 第二章 菊花B病毒、番茄不孕病毒和菊花枯黄斑点类病毒的RT-PCR检测及番茄不孕病毒外壳蛋白的表达
• 1 材料
• 1.1 实验材料
• 1.2 酶以及试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 1.4 溶液配制
• 1.4.1 培养基的配制
• 1.4.2 一般溶液的配制
• 1.4.3 实验试剂的配置
• 1.4.3.1 质粒的提取
• 1.4.3.2 感受态细胞的制备
• 1.4.3.3 SDS-PAGE电泳试剂
• 2 实验方法
• 2.1 菊花总RNA的提取
• 2.2 RT-PCR扩增菊花病毒基因
• 2.2.1 第一链的反转录
• 2.2.3 引物设计
• 2.2.4 PCR扩增
• 2.2.5 电泳检测及目的片段的回收
• 2.3 目的片段的克隆及酶切鉴定
• 2.3.1 目的片段与pGEM-T Vector连接
• 2.3.2 大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）
• 2.3.3 转化
• 2.3.4 重组质粒的提取（碱裂解法）
• 2.3.5 重组质粒验证
• 2.4 RT-PCR检测CChMVd的灵敏度测试
• 2.5 两重PCR及灵敏度测试
• 2.6 利用RT-PCR的方法检测菊花脱毒植株
• 2.6.1 菊花脱毒与非脱毒植株总RNA的提取与cDNA第一条链的合成
• 2.6.2 RT-PCR检测脱毒效果
• 2.7 TAV原核表达载体的构建
• 2.7.1 pGEM-TAV和表达载体pET-30a（+）的酶切
• 2.7.2 TAV CP基因和和表达载体pET-30a（+）的连接
• 2.7.3 转化
• 2.7.4 重组质粒的提取及鉴定
• 2.7.5 TAV CP蛋白的原核表达
• 3 结果与分析
• 3.1 菊花总RNA的检测
• 3.2 菊花B病毒、番茄不孕病毒和菊花枯黄斑点类病毒基因的RT-PCR扩增
• 3.3 基因克隆、测序及序列分析
• 3.4 RT-PCR检测CChMVd的灵敏度测试
• 3.5 利用两重PCR同时检测菊花B病毒和番茄不孕病毒及检测灵敏度分析
• 3.6 两重PCR检测菊花脱毒植株
• 3.7 TAV CP的原核表达
• 3.7.1 pGEM-TAV和原核表达载体pET-30a（+）酶切
• 3.7.2 TAV CP基因和原核表达载体pET-30a（+）连接
• 3.7.3 TAV CP蛋白的原核表达
• 4 讨论
• 第三章 匍匐小菊叶盘再生体系的建立
• 1 材料
• 1.1 实验材料
• 1.2 生化试剂
• 1.3 溶液配制
• 1.4 主要仪器与设备
• 2 实验方法
• 2.1 培养条件
• 2.2 菊花无菌苗体系的建立
• 2.3 6-BA和NAA不同浓度配比对菊花品种叶片外植体再生的影响
• 3 结果与分析
• 3.1 匍匐菊无菌苗体系
• 3.2 匍匐小菊叶盘再生
• 3.3 6-BA和NAA不同浓度配比对菊花品种叶片外植体再生的影响
• 4 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间己发表和待发表的论文
• 致谢