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Sclerostin分子在骨骼力学信号转导中的作用及其机制研究

2020-12-07阅读(794)

Sclerostin分子在骨骼力学信号转导中的作用及其机制研究

论文摘要

应力负荷是控制骨量的一个关键因子。生理水平的应力负荷能保持或增加骨量,而去应力负荷（减少或丧失应力负荷）则会导致骨丢失,废用性骨质疏松症就是一个这样的例子,给长期卧床的患者和宇航员带来极大的危害。在体内靶向敲除骨细胞的研究证实骨细胞是负责进行力学信号转导的主要细胞类型,但是骨骼对去应力负荷作出应答的细胞学和分子水平的机制还很不清楚。Wnt/β-catenin信号通路是调控骨量的一个关键分子信号通路,但是它是否参与骨骼对去应力负荷作出的应答还不知道。Sclerostin蛋白是一个强烈抑制骨骼生长的蛋白,但是其作用的细胞学和分子机制还需研究。另外,其表达特点暗示它有可能在力学信号转导中起作用。在本文中我们要研究Sclerostin作用的机制,以及Sclerostin和Wnt/β-catenin信号通路在骨骼对去应力负荷作出应答中的作用。首先我们让野生型小鼠进行2周的尾巴悬吊实验使其后肢处于去应力负荷状态,我们发现去应力负荷使骨组织的Wnt/β-catenin信号通路活性下降了,并且这伴随着Sost的上调。这促使我们制备了Sost基因敲除小鼠。在此小鼠中,我们用LacZ和筛选标记Neomycin基因取代了基因组上原来的Sost的编码序列。Sost-/-小鼠的骨量跟野生型同窝对照相比极大地增加了。为了研究Sclerostin作用的分子机制,我们从7周龄小鼠的Sost-/-和野生型对照的股骨中抽提了全蛋白、核蛋白以及RNA,进行Western Blot和Real-time PCR检测基因表达。在Sost-/-股骨中,进入细胞核中的β-catenin增加了,相对应的,会被靶向降解的磷酸化β-catenin减少了,另外Wnt/β-catenin信号通路的两个靶基因Lef-1和Connexin 43的表达量都增加了,这些结果揭示了在Sost-/-骨骼中Wnt/β-catenin信号通路的活性升高。而磷酸化SMAD1/5/8的水平和BMP信号通路的靶基因Id-1的表达量在Sost-/-和野生型的股骨中没有差异,这说明Sost敲除中BMP信号通路活性没有变化。因此,Sclerostin在分子水平通过拮抗Wnt/β-catenin信号通路起作用,而其对BMP信号通路没有作用。接着我们研究Sclerostin在细胞水平的作用机制。对骨骼蛋白检测凋亡的分子标记Bax,Bcl-2,Bcl-XL的水平显示Sost-/-骨骼细胞凋亡下降。对骨骼切片行TUNEL检测显示在Sost-/-骨骼中,骨细胞和成骨细胞的凋亡受到抑制。另外,Sost-/-骨骼中成骨细胞活性显著升高。但是从新生小鼠头骨中分离的原代成骨细胞的活性在Sost-/-和野生型中没有差异,说明Sost-/-小鼠中成骨细胞的高活性不是细胞自主性的。这些数据说明,生理条件下骨细胞分泌的Sclerostin促进骨细胞和成骨细胞的凋亡并抑制成骨细胞活性。为了直接研究Sclerostin在骨骼对去应力负荷进行应答中的作用,我们对17周龄和7周龄的雌性Sost基因敲除鼠和野生型小鼠进行了为期14天的尾巴悬吊实验。在野生型小鼠中,去应力负荷使后肢的骨密度和骨容量显著下降了,然而有趣的是,在Sost-/-鼠中,后肢骨的骨密度和骨容量在废用后没有下降。其它骨骼微观结构参数也表现同样的结果。这表明Sost被敲除的小鼠可以抑制由去应力负荷引起的骨丢失。在细胞水平,野生型小鼠在尾巴悬吊后其后肢的骨形成速度显著下降了,而Sost-/-在悬吊后其后肢的骨形成速度不变。在分子水平,野生型中在悬吊后其后肢的Wnt/β-catenin信号通路活性下降,而Sost-/-在悬吊后其后肢的Wnt/β-catenin信号通路没有改变。这些结果说明,Sclerostin是连接骨细胞感受应力负荷和骨形成被调节这两个事件的纽带,而Wnt/β-catenin信号通路则是介导去应力负荷对骨骼的效应的关键信号通路。本研究利用Sost基因敲除小鼠首次提供了Sclerostin拮抗Wnt/β-catenin信号通路的体内证据,并且发现Sclerostin和Wnt/β-catenin信号通路在介导骨骼对去应力负荷的应答反应中起到关键的作用,推动了阐明废用性骨质疏松症的发病机理。我们的结果显示Sclerostin可以作为预防和治疗废用性骨质疏松症的优秀靶点。另外,基于Sostdc1在体外受Ihh诱导的发现,我们制备了Sostdc1条件性敲除小鼠。Sostdc1敲除后表现出多牙表型,但无骨骼的异常。我们还基于中国汉族人群进行了5-HTT与精神分裂症的关联分析,发现5-HTT有2个单倍型表现出与精神分裂症显著性关联。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 文中常用缩写列表
  • 第一章 研究背景简介
  • 1.应力负荷与骨质疏松症
  • 2. 力学信号转导
  • 3.Wnt/β-catenin 信号通路
  • 4.Sclerostin
  • 第二章 材料与方法
  • 1. 材料
  • （1） 细菌与质粒
  • （2） 细胞株与小鼠品系
  • （3） 试剂与抗体
  • （4） 自制溶液
  • （5） 引物
  • 2. 方法
  • （1） DNA 相关方法
  • （2） RNA 相关方法
  • （3） 蛋白相关方法
  • （4） 细胞相关方法
  • （5） 小鼠分析方法
  • （6） 骨骼组织学实验
  • 第三章 Sost 基因敲除小鼠模型的制备和骨骼表型分析
  • 1. 简介
  • （1） 目标及研究策略
  • （2） 方法背景
  • 2. 分析与结果
  • （1） 应力负荷减少时骨组织 Wnt/β-catenin 信号通路活性下降
  • （2） 基因打靶载体的制备以及胚胎干细胞的筛选
  • （3） Sost 基因敲除小鼠模型的获得和鉴定
  • （4） Sost 基因敲除小鼠表现出骨量极大增高
  • （5） Sost 基因敲除小鼠的骨骼发育正常
  • 3. 讨论
  • 第四章 Sclerostin 抑制骨形成的分子和细胞学机制
  • 1. 简介
  • （1） 目标及研究策略
  • （2） 方法背景
  • 2. 分析与结果
  • （1） Sclerostin 在体内特异拮抗 Wnt/β-catenin 信号通路
  • （2） Sclerostin 促进骨细胞和成骨细胞的凋亡并抑制成骨细胞成骨活性
  • 3. 讨论
  • 第五章 Sclerostin 介导骨骼对去应力负荷的应答反应
  • 1. 简介
  • （1） 目标及研究策略
  • （2） 方法背景
  • 2. 分析与结果
  • -/- 基因敲除小鼠在尾巴悬吊情况下不发生骨丢失'>（1） Sost-/-基因敲除小鼠在尾巴悬吊情况下不发生骨丢失
  • -/- 基因敲除小鼠在尾巴悬吊情况下骨形成不变化'>（2） Sost-/-基因敲除小鼠在尾巴悬吊情况下骨形成不变化
  • -/- 基因敲除小鼠在尾巴悬吊情况下 Wnt/β-catenin 信号通路活性不下降'>（3） Sost-/- 基因敲除小鼠在尾巴悬吊情况下 Wnt/β-catenin 信号通路活性不下降
  • 3. 讨论
  • 第六章 Sostdc1 条件性基因敲除小鼠模型的制备及其表型分析以及5-HTT 与精神分裂症的关联研究
  • 1. 简介
  • 2. 分析与结果
  • （1）Sostdc1 在骨骼中的表达
  • （2） 基因打靶载体的制备及胚胎干细胞的筛选
  • （3） Sostdc1 条件性基因敲除小鼠模型的获得和鉴定
  • （4） Sostdc1 敲除小鼠表型分析
  • （5） 5-HTT 与精神分裂症表现出单倍型的阳性关联
  • 3. 讨论
  • 第七章 总结与展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读博士学位期间发表的学术论文目录

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