海洛因海绵状白质脑病神经病理及少突胶质细胞凋亡机制研究

论文摘要

海洛因海绵状白质脑病（heroin spongiform leukoencephalopathy HSLE）是指经鼻烫吸海洛因干馏物后出现的以脑白质海绵状空泡变性为病理特征,以小脑性共济失调为主要症状的中枢神经系统器质性疾病。1982年Wolters E在荷兰阿姆斯特丹首次报道47例。2000年陆兵勋教授等首次在我国报道28例HSLE患者。目前世界多个国家和地区均有个案报道。影像学检查发现HSLE呈广泛对称性白质病变,以小脑半球、内囊后肢、胼胝体压部及顶枕叶白质易受损。脑脊液检查碱性髓鞘蛋白（myelin bases protein MBP）增高。其发病可能与中枢神经系统脱髓鞘有关。单独静脉注射海洛因者未发现HSLE发病。从零售的海洛因粉剂中已鉴定出大量搀杂物,如安定、异烟肼、滑石粉等物质,推测可能是某种搀杂物引起HSLE,而不是海洛因本身。但病因和发病机制不清。有研究证实多种因素均可引起脑白质脱髓鞘和少突胶质细胞凋亡,最终导致轴突脱髓鞘及传导性能丧失。调节细胞凋亡因子bcl-2/bax比值减少可能直接导致神经元凋亡通路。环己铜草酰二腙可引起脑白质脱髓鞘改变,并具有明显的区域分布,胼胝体压部及后穹隆病灶明显,而胼胝体膝部及前小脑脚则没有明显的脱髓鞘改变。本研究以影像学及神经病理学分析HSLE脑白质脱髓鞘及脑水肿特征,用海洛因搀杂物及环己铜草酰二腙探索制备大鼠脑白质改变模型,并与HSLE相比较,从少突胶质细胞凋亡及调控因子bcl-2/bax着手,研究HSLE脑水肿特征及少突胶质细胞凋亡的发病机制。1海洛因海绵状白质脑病影像学及神经病理特征研究1.1研究目的通过MRI检查、HE染色和MBP免疫组化方法,研究和探讨HSLE脱髓鞘和海绵状空泡变性特征。1.2研究方法HSLE住院患者6例（南方医科大学南方医院）,头颅MRI采集T1WI、T2WI、水抑制、增强及MRA影像,综合分析脑部病变定位、定性及脑血管改变情况。4例HSLE尸检脑组织,5例正常对照脑组织（来源于非脑部病变死亡尸检病例）。HE染色、MBP免疫组化及透射电镜检测脑白质脱髓鞘、空泡变性及超微结构特征。1.3研究结果1.3.1头颅MRI检查大脑皮质变薄,脑白质扩大,病灶周边无明显脑水肿,无明显占位效应。6例患者均存在小脑白质、胼胝体压部、内囊后支及枕叶白质病灶。病灶呈长T1WI、长T2WI。双侧大脑FLAIR像病灶呈高信号,较T2WI稍减低,增强无强化。MRA显示各主干动脉纤细,分支减少,与临床症状严重程度成正比。1.3.2透射电镜HSLE脑白质脱髓鞘改变,少突胶质细胞多发性空泡变性,在其残留的胞浆中可见肿胀的线粒体及膨胀的内质网。1.3.3 HE染色HSLE患者脑白质疏松,大脑白质、小脑白质、胼胝体空泡形成,沿轴索走行。大脑白质由浅层到深层,空泡样改变逐渐明显,结构散乱。小脑颗粒下层白质空泡较大,向深层白质空泡渐小而密集。白质血管周围空泡形成明显。皮质下白质、胼胝体轴索肿胀,细胞核分散。1.3.4 MBP染色髓鞘染色成棕褐色,大脑白质、小脑白质及胼胝体染色浅,染色不均,空泡样无着色区由浅层到深层逐渐增多、加重,髓鞘纤维断裂、崩解,白质疏松。1.4研究结论（1）HSLE白质病变区影像学髓鞘明显减少;（2）HSLE形态学脑白质脱髓鞘和空泡变;（3）HSLE存在血管痉挛及继发性微循环改变;（4）HSLE白质空泡变性与血管改变有关。2 bcl-2/bax基因表达和少突胶质细胞凋亡在海洛因海绵状白质脑病发病机制中的作用研究2.1研究目的检测HSLE脑组织细胞凋亡及其调节因子,研究HSLE少突胶质细胞凋亡的发病机制2.2研究方法4例HSLE尸检脑组织,5例正常对照脑组织（来源于非脑部病变死亡尸检病例）。检测大脑白质、小脑白质和胼胝体区TUNEl阳性细胞、caspase-3阳性表达及bcl-2/bax基因表达并计数,统计分析采用SPSS 13.0软件包,各阳性细胞数据用均数±标准差（x-±s）表示,病例组与对照组不同脑区比较采用重复测量数据的方差分析,多重比较采用LSD方法,相同脑区两组间比较采用独立样本t检验,TUNEL细胞凋亡计数与caspase-3表达之间的关系采用-Pearson相关检验。2.3研究结果2.3.1 TUNEL细胞凋亡检测HSLE患者大脑白质有少量凋亡阳性细胞,小脑白质、胼胝体部位大量细胞核呈棕褐色,深染不均,计数明显高于对照组,与对照组相比差异有显著统计学意义（F=327.913,P=0.000）;部位间比较差异有统计学意义（F=68.100,P=0.000）,部位间多重比较,小脑白质与胼胝体之间差异无统计学意义（P=0.310）,大脑白质与小脑、胼胝体比较差异有统计学意义（P=0.018,P=0.017）;两组不同脑区之间交互效应具有统计学意义（F=83.715,P=0.000）。2.3.2 Caspase-3免疫组化阳性表达caspase-3阳性细胞广泛存在于HSLE大脑、小脑和胼胝体白质,以病灶中心部位为最明显,在边缘区及相对病变程度轻的额叶,也有少量细胞凋亡。两组间比较差异有统计学意义（F=387.955,P=0.000）;部位间比较差异有显著统计学意义（F=215.727,P=0.000）,部位间多重比较,小脑白质与胼胝体之间差异无统计学意义（P=0.096）,大脑白质与小脑白质（P=0.020）、胼胝体（P=0.022）比较差异有显著统计学意义;TUNEL阳性计数与caspase-3阳性计数之间存在正相关（pearson r=0.924,P=0.000）。脑白质主要由少突胶质细胞形成髓鞘,表明HSLE脑白质存在广泛大量少突胶质细胞凋亡。2.3.3 Bcl-2基因表达HSLE与对照组间比较差异无统计学意义（F=0.001,P=0.978）,大脑白质、小脑白质及胼胝体部位间比较差异无统计学意义（F=0.001,P=0.999）。2.3.4 Bax基因表达两组间比较差异有显著统计学意义（F=11.098,P=0.013）,HSLE部位间比较差异有显著统计学意义（F=5.632,P=0.016）,部位间多重比较,小脑白质与胼胝体之间差异无统计学意义（P=0.952）,大脑白质与小脑白质（P=0.032）、胼胝体（P=0.035）比较差异有显著统计学意义。Bcl-2为促生存家族,bax为促凋亡家族,HSLE脑白质bax表达增高与细胞凋亡有关,Bax高表达使线粒体细胞色素C释放,致使Caspases-9和Caspases-3激活而诱导凋亡,Bax与Bcl-2的相对比值在决定细胞生存或死亡中可能起关键作用。2.4研究结论（1）少突胶质细胞凋亡是脱髓鞘的原因;（2）TNF受体1结合后激活caspase-3导致少突胶质细胞凋亡;（3）Bcl-2/Bax比值减少促使少突胶质细胞凋亡。3环己铜二腙诱导大鼠脑白质空泡样变性特征及少突胶质细胞凋亡研究3.1研究目的通过探索并建立脑白质海绵状空泡变性模型,进一步研究其病因及发病机制,为HSLE病因及发病机制研究提供新的研究内容和思路。3.2研究方法SD大鼠72只,动物分组:搀杂物烟熏组（搀熏组）、搀杂物喂食组（搀喂组）、环己铜二腙组（铜腙组）、生理盐水组（对照组）,每组分2周、4周、6周3个时间段,每时间段6只SD大鼠。搀杂物按安定:苯巴比妥:异烟肼:水合硅酸镁=2.5∶30∶100∶200的比例研磨成粉备用。搀杂物混合粉剂染毒量每次25mg/100g体重。铜腙组将环己铜二腙配制成1%混悬液,按10mg/100g体重经口灌胃;对照组予等量生理盐水灌胃。均为1次/日。制备SD大鼠脑白质空泡变性膜型,在相应时间点脑组织取材、固定。HE染色、MBP免疫组化髓鞘染色检测脑白质脱髓鞘及空泡变性特征;透射电镜观察胼胝体压部超微结构;TUNEL技术及caspase-3免疫组化检测细胞凋亡。统计学方法:应用SPSS 13.0软件包,TUNEL及caspase-3阳性细胞数据用均数±标准差（x-±s）表示,各组相同脑区及不同时间点之间进行析因方差分析。3.3研究结果3.3.1实验鼠大体脑标本72例SD大鼠脑表面灰白色,无充血、肿胀,各组大体观察无明显差异。3.3.2 HE染色搀熏组、搀喂组、铜腙2、4周组及对照组大、小脑结构正常,白质内未见空泡样改变。铜腙6周组可见大鼠脑白质空泡形成,空泡呈长条形或椭圆形,沿纤维走行,以脑干和枕顶叶白质空泡样改变最明显,血管无明显改变,血管周围无明显空泡,无明显炎细胞浸润,未见坏死区,未见明显胶质细胞增生,大脑灰质神经细胞和小脑灰质Purkinje细胞未见缺失和变性。3.3.3透射电镜铜腙4周组大鼠,可见髓鞘排列较紊乱,部分结构松解变性,但无典型脱髓鞘改变,铜腙6周组大鼠脑胼胝体可见髓鞘肿胀,髓鞘板层内有空泡形成。3.3.4 MBP免疫组化染色搀熏组、搀喂组、铜腙2、4周组及对照组大鼠脑白质、胼胝体染色均匀,未见组织疏松、空泡形成等改变。铜腙6周组可见大鼠脑白质淡染、稀疏,髓鞘中断或被挤向两侧,出现无着色空泡,以脑干和顶枕叶白质最明显。3.3.5 TUNEL染色铜腙2周组脑白质偶见散在细胞凋亡,铜腙4周组可见脑白质较多凋亡阳性细胞,深染不均,铜腙6周组可见脑室周白质、小脑白质、胼胝体及脑干部位大量凋亡细胞,分布在空泡区,各组TUNEL计数比较差异具有显著统计学意义（F=309.934,P=0.000）,不同时间之间相比差异具有显著统计学意义（F=163.839,P=0.000）,各组不同时间交互效应有显著统计学意义（F=155.270,P=0.000）,铜腙组与搀熏组、搀喂组及对照组比较差异均有统计学意义（P=0.000）,6周组与2周组、4周组比较均有显著统计学意义（P=0.000）,4周组与2周组比较具有显著统计学意义（P=0.000）,以铜腙6周组最高,其次为铜腙4周组,其余各组及各时间之间差异无统计学意义。提示铜腙4周组脑白质已出现细胞凋亡,随着时间延长,到6周时细胞凋亡加重。3.3.6 caspase-3免疫组化铜腙4周组可见脑白质较多凋亡阳性颗粒,深染不均,铜腙6周组可见皮质下白质、小脑白质、胼胝体及脑干部位大量凋亡细胞,分布在脑白质空泡区,各组之间差异具有显著统计学意义（F=84.018,P=0.000）,不同时间之间差异具有显著统计学意义（F=23.611,P=0.000）,铜腙组与搀熏组、搀喂组及对照组比较差异均有统计学意义（P=0.000）,6周组与2周组、4周组比较均有显著统计学意义（P=0.000）,4周组与2周组比较有显著统计学意义（P=0.003）,以铜腙6周组最高,其次为铜腙4周组,其余各组及各时间之间差异无统计学意义。提示铜腙4周组脑白质出现细胞凋亡信号,随着时间延长,到6周时细胞凋亡加重。与TUNEL凋亡染色相一致,与HE染色及MBP髓鞘染色形态学损害区相一致。说明细胞凋亡与脑白质海绵状空泡变性有关,细胞凋亡可能为脑白质海绵状空泡变性的原因之一。3.4研究结论（1）安定、苯巴比妥、异烟肼、水合硅酸镁混合物烟熏或喂食未致鼠脱髓鞘和空泡变;（2）海洛因搀杂物未引起SD鼠白质细胞凋亡;（3）鼠经口摄入铜腙主要损害靶点在CNS少突胶质细胞,其凋亡致空泡样变;（4）铜腙喂食致SD鼠脑白质脱髓鞘及空泡变性,无血管相关性;（5）出现细胞凋亡（4W）早于出现脑白质脱髓鞘和空泡变性（6W）,细胞凋亡是脱髓鞘及空泡变的先导;（6）细胞凋亡与脱髓鞘、空泡形成有关,呈时间剂量相关性,随铜腙摄入时间延长、总剂量增加,细胞凋亡增多。4全文总结（1）HSLE白质病变区影像学髓鞘明显减少;（2）HSLE形态学脑白质脱髓鞘和空泡变;（3）HSLE存在血管痉挛及继发性微循环改变;（4）HSLE白质空泡变性与血管改变有关;（5）少突胶质细胞凋亡是脱髓鞘的原因;（6）TNF受体1结合后激活caspase-3导致少突胶质细胞凋亡;（7）Bcl-2/Bax比值减少促使少突胶质细胞凋亡;（8）安定、苯巴比妥、异烟肼、水合硅酸镁混合物烟熏或喂食未致鼠脱髓鞘和空泡变;（9）海洛因搀杂物未引起SD鼠白质细胞凋亡;（10）鼠经口摄入铜腙主要损害靶点在CNS少突胶质细胞,其凋亡致空泡样变;（11）铜腙喂食致SD鼠脑白质脱髓鞘及空泡变性,无血管相关性;（12）出现细胞凋亡（4W）早于出现脑白质脱髓鞘和空泡变性（6W）,细胞凋亡是脱髓鞘及空泡变的先导;（13）细胞凋亡与脱髓鞘、空泡形成有关,呈时间剂量相关性,随铜腙摄入时间延长、总剂量增加,细胞凋亡增多。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 海洛因海绵状白质脑病影像学及神经病理特征研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 第二章 bcl-2/bax基因表达和少突胶质细胞凋亡在海洛因海绵状白质脑病发病机制中的作用研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 第三章 环己铜二腙诱导大鼠脑白质空泡变性特征及少突胶质细胞凋亡研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 全文总结
• 本研究创新点
• 附录 英文缩略词表
• 成果 在读博士期间撰写和发表的论文
• 致谢