人肠道细菌Feacalibacterium prausnitzii数量和组成的研究方法的建立和应用

论文摘要

肠道菌群是人体内最复杂的共生微生物生态系统,无论是健康或疾病状态下,人体生理代谢都不可避免地受到肠道菌群结构变化的影响。Feacalibacterium prausnitzii是人肠道中数量最占优势的细菌之一,占细菌总数的7%以上,并在人群中广泛分布。肠道细菌F. prausnitzii具有重要的生理功能:能够为肠上皮细胞提供能量;可以影响宿主多个代谢通路;可能通过甲胺类物质的代谢与胰岛素抵抗相关;具有抗肠道炎症的特性。但是该种菌严格厌氧且难于培养,因此,使用分子方法对该细菌在中国人群中的数量和组成进行分析,对解析F. prausnitzii与人体健康和疾病的关系具有重要的意义。本研究首先比较3对基于16S rRNA基因、用于检测F. prausnitzii的引物（FPR-1-FPR-2、FPR-2F-Fprau645R和Fprau223F-Fprau420R）的特异性,选取特异性最好的1对用于后续定量和组成的研究。用Clustal X比对每个引物与F. prausnitzii和其他细菌的16S rRNA基因的序列。在Ribosomal Database Project（RDP）数据库中使用Probe Match工具比较每个引物匹配的Faecalibacterium spp.序列数目。利用本课题组建立的中国人粪便菌群的16S rRNA基因全长文库的7255个克隆序列,用Simulated PCR（SPCR）预测每对引物检测到的F. prausnitzii和其他细菌的克隆数;用3对引物分别对代表克隆进行PCR扩增。结果显示:引物Fprau645R的3’端最后一个碱基与非F. prausnitzii序列的错配度高于其它引物,它在RDP中匹配的Faecalibacterium spp.序列数占其匹配的细菌序列数的百分比（97.6%）显著高于其他引物。SPCR预测,3对引物检测到的F. prausnitzii克隆数均为1171左右;在检测到的非Faecalibacterium spp.克隆中,FPR-2F-Fprau645R主要是Subdoligranulum spp.,而FPR-1-FPR-2和Fprau223F-Fprau420R还有Oscillibacter spp.、Ruminococcus spp.和unclassified Ruminococcaceae等。真实PCR与SPCR的结果吻合。结果表明3对引物能检测到F. prausnitzii和Subdoligranulum spp.,FPR-2F-Fprau645R的特异性优于FPR-1-FPR-2和Fprau223F-Fprau420R。接着,运用FPR-2F-Fprau645R这对引物,我们摸索了F. prausnitzii特异性的实时定量PCR方法,并建立了F. prausnitzii特异性的变性梯度凝胶电泳（DGGE）的分析方法,并用这两种方法调查了56个单纯性肥胖和57个正常体重成人（年龄、性别、居住地一一匹配,其中女性63人,男性50人）粪便中F. prausnitzii的数量和组成。F. prausnitzii特异性实时定量PCR结果显示,女性肠道中F. prausnitzii的数量显著高于男性（P=0.005）,其中在正常体重组,得到的结果同上,而在肥胖组并没有得到上述性别间的差异,提示F. prausnitzii在不同性别间存在数量差异。粪便F. prausnitzii的数量与体质指数（BMI）相关（R=0.214,P=0.023）,提示F. prausnitzii与肥胖可能存在一定的关系。相比于正常体重志愿者,肥胖志愿者肠道中F. prausnitzii的数量较多,但是差异并不显著（P=0.101）。F. prausnitzii类群特异性的PCR-DGGE方法对14个肥胖个体和13个正常体重对照个体进行了分析。发现两组人群的F. prausnitzii的组成没有明显的差异。综上所述,FPR-2F-Fprau645R是检测粪便F. prausnitzii的特异性较好的引物。人粪便F. prausnitzii的数量具有性别差异,并与肥胖具有一定的关系。本研究利用新建立的F. prausnitzii特异性的PCR-DGGE方法,发现F. prausnitzii的组成在肥胖和正常体重人群间没有明显差异。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 人体肠道微生物研究进展
• 1.1.1 人体肠道微生物概述
• 1.1.2 肠道内有重要生理学意义的微生物组成
• 1.1.2.1 梭菌
• 1.1.2.2 拟杆菌
• 1.1.2.3 双歧杆菌
• 1.1.2.4 肠杆菌
• 1.1.2.5 乳酸菌
• 1.1.2.6 其他重要细菌类群和古菌
• 1.1.3 肠道细菌F. prausnitzii 综述
• 1.1.3.1 F. prausnitzii 形态
• 1.1.3.2 F. prausnitzii 系统分类地位
• 1.1.3.3 F. prausnitzii 重要功能
• 1.1.3.4 F. prausnitzii 的研究方法
• 1.1.4 肠道微生物的主要功能
• 1.1.4.1 营养与消化
• 1.1.4.2 促进上皮细胞的生长与分化
• 1.1.4.3 免疫功能
• 1.1.4.4 保护作用
• 1.1.5 肠道微生物与性别的关系
• 1.1.6 肠道微生物与疾病的关系
• 1.1.6.1 肠道菌群与肥胖的关系
• 1.1.6.2 肠道菌群与胰岛素抵抗的关系
• 1.1.6.3 肠道菌群与其它疾病的关系
• 1.2 研究微生物组成多样性的分子生物学技术
• 1.2.1 实时定量PCR 技术
• 1.2.2 变性/温度梯度凝胶电泳技术
• 第二章 建立肠道细菌Feacalibacterium prausnitzii 数量和组成的分析方法
• 引言
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 克隆与引物
• 2.1.1.2 试剂和仪器
• 2.1.1.3 计算机程序和数据库
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 序列的比对和系统发育分析
• 2.1.2.2 RDP 的Probe Match 分析
• 2.1.2.3 SPCR 分析
• 2.1.2.4 真实PCR 验证
• 2.1.2.5 F. prausnitzii 特异性的实时定量PCR
• 2.1.2.6 F. prausnitzii 特异性的PCR-DGGE
• 2.2 结果
• 2.2.1 引物比较
• 2.2.1.1 序列比对和系统发育分析
• 2.2.1.2 RDP 的Probe Match 分析
• 2.2.1.3 SPCR 分析
• 2.2.2 真实PCR 验证结果
• 2.2.3 F. prausnitzii 特异性的实时定量PCR
• 2.2.4 F. prausnitzii 特异性的PCR-DGGE
• 2.3 讨论
• 第三章 应用实时定量PCR技术对中国成年人群肠道中Feacalibacterium prausnitzii进行数量分析
• 引言
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 样本来源
• 3.1.2 粪便基因组DNA 提取
• 3.1.3 F. prausnitzii 特异性实时定量PCR
• 3.1.3.1 DNA 浓度的测定
• 3.1.3.2 粪便样品F. prausnitzii 特异性实时定量PCR 和总菌实时定量PCR
• 3.2 结果
• 3.2.1 实验样品的选择
• 3.2.2 F. prausnitzii 特异性实时定量PCR 结果
• 3.3 讨论
• 第四章 应用PCR-DGGE 技术对中国成年人群肠道中Feacalibacterium prausnitzii 进行组成分析
• 引言
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.1.1 粪便样品来源
• 4.1.1.2 试剂
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 粪便基因组DNA 的提取
• 4.1.2.2 F. prausnitzii 特异性的PCR-DGGE
• 4.2 结果
• 4.3 讨论
• 参考文献
• 附录1 溶液试剂及培养基配方
• 附录2 仪器设备
• 附录3 缩写和全称
• 附录4 F. prausnitzii 特异性实时定量PCR 样品基本信息
• 附录5 F. prausnitzii 特异性实时定量PCR 数据汇总
• 致谢
• 研究生阶段已发表或录用的论文