组蛋白乙酰化修饰调控果蝇热休克基因表达和寿命的分子机制研究

论文题目: 组蛋白乙酰化修饰调控果蝇热休克基因表达和寿命的分子机制研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 细胞生物学

作者: 赵艳梅

导师: 黄百渠

关键词: 热休克蛋白,组蛋白乙酰化,寿命,黑腹果蝇,组蛋白去乙酰化酶抑制剂,基因表达调控

文献来源: 东北师范大学

发表年度: 2005

论文摘要: 衰老是一个普遍的生物学现象,衰老控制着生物寿命的长短,主要受遗传因子和环境因素所影响。了解衰老的分子机制,对于延缓衰老、保持生命活力具有重要的意义。热休克蛋白(HSP)作为高度保守的“分子伴侣”,在细胞内广泛地参与许多复杂的功能活动,可以抵制衰老过程中一些有害蛋白的发生。其基因的表达调控是一种特殊的真核基因表达模式,包括基础水平和诱导水平的表达。由组蛋白乙酰转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)催化的乙酰化反应在真核基因的表达调控中起着重要作用,这两种酶通过对核心组蛋白进行可逆修饰来调节核心组蛋白的乙酰化水平,从而调控转录的起始与延伸。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDI)可以通过抑制 HDAC 活性提高组蛋白乙酰化水平,是研究乙酰化修饰在真核基因表达调控中的作用的有用工具。本论文一方面采用 HDI trichostatin A(TSA)和丁酸钠(BuA)喂食果蝇,改变果蝇体内组蛋白乙酰化水平,系统地研究组蛋白乙酰化修饰、HSP 的表达以及寿命调控三者之间的关系。结果发现 hsp 基因在长寿果蝇中具有较高的基础表达、较快的热激诱导反应速度以及较强的高温抵抗性。同时,不同的 hsp 基因在果蝇衰老过程中的作用不尽相同,hsp22 的作用最为重要,hsp70 次之,而 hsp26 的表达几乎与寿命无关。使用 HDI TSA 和 BuA 喂食果蝇可以延长其寿命,但不同的 HDI 的作用机制不尽相同,同一种 HDI 对不同寿命品系的果蝇的延长程度也不尽相同。TSA 的处理有一种时间依赖性,更长时间的 TSA 处理对寿命是有利的;而 BuA 的处理却与此不同,过长时间的处理反而加速衰老。同样的去乙酰化酶抑制剂,同一剂量处理,在不同果蝇品系种的作用不同,它们对短寿果蝇寿命的延长程度更为明显。另外,HDI 处理还促进果蝇衰老过程中 hsp 基因的基础表达和诱导表达,但是随着衰老的进行,这种促进作用逐渐减弱。同样在不同寿命的果蝇品系中,其提高 hsp 基因表达的程度也不一样。在短寿果蝇中,HDI 对 hsp 基因的促进作用更为明显。另一方面本论文通过 HDI TSA 和 BuA 喂食果蝇幼虫改变体内组蛋白乙酰化水平,初步探讨了乙酰化修饰调控 hsp 基因表达的分子机制。real time RT-PCR 实验显示 HDI 诱导的乙酰化水平的升高对不同 hsp 基因的基础表达的影响不同,促进了hsp22 和 hsp70 的基础表达,抑制了 hsp26 的基础表达;但对 hsp 基因诱导表达的影响是相同的,促进了它们的诱导表达。染色质免疫沉淀(ChIP)实验表明 HDI 诱导的组蛋白 H3 超乙酰化定位于 hsp22、hsp26 以及 hsp70 基因启动子区和转录区。促进了 HSF 与 HSE 的结合;增强了 RNA 聚合酶(pol)Ⅱ向 hsp22 和 hsp70 转录起始位点的招募及转录延伸;但不影响非热激状态下 RNApolⅡ在 hsp26 基因启动子上的招募,只促进热激时 RNA polⅡ对 hsp26 基因的转录。另外,在果蝇 37℃热激 30 分钟内的不同时间点取样,检测了热激过程中 hsp 基因启动子处乙酰化水平的变化情况,结果发现热激过程中,hsp70 和 hsp26 启动子组蛋白 H3 的乙酰化水平呈现一个动态变化的过程;并且 hsp26 启动子不同调控元件处变化趋势不尽相同。同时 real timeRT-PCR 实验显示 hsp26 基因的 mRNA 表达水平在热激过程中呈曲折性上升。通过以上研究,本论文建立了组蛋白乙酰化修饰、HSP 的表达以及寿命调控三者之间的有机联系;初步阐述了组蛋白乙酰化修饰调控 hsp 基因表达的分子机制。为进一步研究衰老的分子机制,确定参与衰老和 hsp 基因调控的乙酰化酶和去乙酰化酶提供了理论依据。

论文目录:

中文摘要

英文摘要

引言

一、研究背景和立题依据

二、亟待解决的问题

三、本文的研究内容和意义

第一章文献综述

一、真核生物染色质结构与基因转录活性

（一）真核生物的染色质结构

（二）核小体重塑复合物

1. 依赖于ATP的核小体重塑复合物

2. 组蛋白酶类修饰复合物

（三）组蛋白乙酰基转移酶的功能及其分类

1. 组蛋白乙酰基转移酶及其复合物的种类

2. 组蛋白乙酰基转移酶及其复合物的功能

（四）组蛋白去乙酰化酶及其抑制剂

1. 组蛋白去乙酰化酶的分类

2. 组蛋白去乙酰化酶的功能

3. 组蛋白去乙酰化酶抑制剂

二、热休克蛋白的生物学功能及其表达调控

（一）热休克蛋白的生物学功能

1. 热休克蛋白的分子伴侣活性

2. 热休克蛋白与细胞凋亡

3. 热休克蛋白与免疫调控

4. 热休克蛋白在衰老中的作用

（二）热休克蛋白的表达调控

1. 热休克基因的顺式作用元件

2. 热休克基因的反式作用因子

3. 热休克基因的表达调控

4. 组蛋白乙酰化修饰与热休克基因表达调控的关系

三、生物衰老与寿命调控

（一）机体代谢速率与寿命

（二）氧化损伤与衰老

1. 活性氧及其来源

2. 活性氧代谢

3. 不饱和脂肪酸

（三）类固醇激素对寿命的调控

1. 类固醇对寿命的调控

2. 胰岛素/IGF 信号通路在寿命调控中的作用

（四）果蝇中影响寿命的基因

1. 基因功能降低可延长寿命的基因

2. 过表达延长寿命的基因

第二章组蛋白乙酰化修饰、热休克蛋白表达和果蝇寿命的关系研究

一、实验材料与方法

（一）实验材料

1. 果蝇

2. 主要试剂

（二）实验方法

1. 果蝇的培养

2. 果蝇寿命统计

3. 筛选长寿和短寿的果蝇品系

4. 果蝇的去乙酰化酶抑制剂处理和热激诱导

5. 果蝇总RNA 的提取

6. 逆转录PCR

7. 定量Real Time PCR

8. 果蝇全蛋白及核蛋白的提取

9. SDS-PAGE 电泳和Western Blotting 分析

二、结果与分析

（一）实验条件的确定

1. RT-PCR 反应中模板浓度的确定

2. RT-PCR 反应循环数的确定

3. 果蝇温和热激诱导温度的确定

（二）果蝇长寿品系和短寿品系的筛选

（三）热休克蛋白的表达与果蝇寿命的关系

1. 不同寿命的果蝇衰老过程中hsp 基因基础表达的差异

2. 不同寿命的果蝇hsp 基因热诱导反应灵敏度和诱导强度的差异

3. 不同寿命的果蝇耐热能力的差异

（四）组蛋白乙酰化修饰以及热激诱导与果蝇寿命的关系

1. HDI处理和热激诱导对果蝇体内组蛋白乙酰化水平的影响

2. HDI处理和热激诱导对果蝇寿命长短的影响

（五）果蝇衰老过程中组蛋白乙酰化修饰与HSP 表达调控的关系

1. HDI处理对果蝇衰老过程中hsp m RNA表达水平的影响

2. HDI处理对果蝇衰老过程中 Hsp 蛋白表达水平的影响

三、讨论

（一）热休克基因的表达与果蝇寿命

（二）组蛋白乙酰化修饰与果蝇热休克基因表达调控的关系

（三）组蛋白乙酰化与去乙酰化修饰与果蝇寿命

（四）去乙酰化酶抑制剂延长果蝇寿命的分子模型

四、小结

第三章组蛋白乙酰化修饰影响果蝇hsp 基因表达调控的分子机制研究

一、实验材料与方法

（一）实验材料

1. 果蝇三龄幼虫

2. 主要试剂

（二）实验方法

1. 果蝇的培养

2. 果蝇的去乙酰化酶抑制剂处理和热激诱导

3. 染色质免疫沉淀

二、实验结果与分析

（一）果蝇幼虫中CHIP 实验体系的建立

1. ChIP 实验中果蝇幼虫用量的确定

2. ChIP 实验DNA 剪切条件的确定

3. 甲醛交联的浓度和时间的确定

4. 实验体系的确立

（二）组蛋白乙酰化修饰调控hsp22 基因表达的分子机制

1. HDI 处理提高了果蝇幼虫hsp22 的mRNA 表达水平

2. HDI 处理诱导果蝇幼虫组蛋白H3 的超乙酰化

3. HDI 处理诱导了hsp22 基因位点处组蛋白H3 的超乙酰化

4. 组蛋白H3的超乙酰化有利转录因子与特异序列的结合

5. 组蛋白H3 的超乙酰化增强了RNA polⅡ的转录起始与延伸

（三）组蛋白乙酰化修饰调控hsp70 基因表达的分子机制研究

1. HDI处理对hsp70 基因位置处组蛋白H3 乙酰化水平的影响

2. 热激过程中hsp70 基因启动子处组蛋白H3 乙酰化水平的变化

3. 乙酰化水平的变化对转录因子结合的影响

4. 组蛋白乙酰化水平的变化对hsp70 转录的影响

（四）组蛋白乙酰化修饰调控hsp26 基因表达的分子机制研究

1. HDI 处理对hsp26 基因mRNA 表达水平的影响

2. HDI处理对hsp26基因启动子不同调控元件处组蛋白H3乙酰化水平的影响

3. 组蛋白H3 的超乙酰化对转录因子结合的影响

4. 热激过程中hsp26启动子处组蛋白H3乙酰化水平的变化

5. 组蛋白乙酰化修饰与RNA polⅡ转录的关系

三、讨论

（一）组蛋白乙酰化修饰参与果蝇热休克基因的表达调控

（二）乙酰化修饰与转录因子、转录因子与转录因子之间的关系

（三）乙酰化修饰与RNA polⅡ转录的关系

（四）参与hsp基因表达的组蛋白乙酰化酶和去乙酰化酶

（五）热激过程中hsp基因启动子处染色质的重塑

（六）热休克基因表达调控的分子模型

四、小结

本论文的结论与创新点

参考文献

英文缩写词

致谢

作者简介

发布时间: 2005-07-07

参考文献

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