hwtx-Ⅰ基因四价体表达载体构建及苏云金芽孢杆菌工程菌株研究

论文摘要

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）编码杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins,ICPs）的cry基因中cry1类基因的启动子是一类芽孢依赖型启动子,从芽孢形成T2期开始被激活。虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ（Huwentoxin-Ⅰ,简称Hwtx-Ⅰ）是虎纹捕鸟蛛分泌产生的一类乙酰胆碱受体阻断剂,作用于神经肌肉的连接处,能阻断神经肌肉的信号传导,其溶液构象为三对二硫键和三股反平行β折叠的抑制剂胱氨酸结构模体。同时,其生物学活性表明也是一种N型Ca2+离子通道的阻断剂。本研究根据已知的Hwtx-Ⅰ氨基酸序列,按照苏云金芽孢杆菌偏爱密码,将氨基酸序列转换成核苷酸序列,并将其基因单价体分片段化学合成。将合成片段磷酸化并退火连接。同时设计一段含有核酸内切酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ位点的衔接子linker,利用这两种内切酶酶切后的粘性末端互补这一特性,可将hwtx-Ⅰ基因头尾串联形成四价体。 带有Bt杀虫晶体蛋白基因cry1Ac的质粒pUA19经内切酶BsaBI和MunI酶切后,去掉了cry1Ac基因的ORF,只剩下cry1Ac基因的上游启动子序列和下游终止子序列。将设计的linker片段插入此位点,得到pUAK质粒,利用内切酶SpeⅠ和Xba Ⅰ双酶切后将已退火连接好的hwtx-Ⅰ基因插入其中,得到质粒pUKH1。将质粒pUKH1分别用SalⅠ/SpeⅠ 和Sal Ⅰ/Xba Ⅰ双酶切回收其中目的片段,连接后得到质粒pUKH2,将此质粒分别用SalⅠ/JpeⅠ和Sal Ⅰ/Xba Ⅰ双酶切回收其中目的片段,连接后得到质粒pUKH4。将pUKH4用Sal Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切回收1.1kb片段,与同样双酶切的大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌的穿梭载体pHT304连接得到表达质粒pXH4。将pXH4分别电转入苏云金芽孢杆菌无晶体突变株XBU001和野生型菌株Bt4.0718中,Hwtx-Ⅰ四价体在苏云金芽孢杆菌转化子中得到表达,蛋白质定量分析显示目的蛋白摇瓶发酵表达量达到14.0mg/L。目的蛋白在XBU001的重组子UH04中占可溶性蛋白总量的11.48%,在Bt4.0718的重组子Bh4-4中占可溶性蛋白总量的4.51%。生测结果显

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 1.苏云金芽孢杆菌概论
• 1.1 苏云金芽孢杆菌概述
• 1.2 苏云金芽孢杆菌杀虫活性成分
• 1.3 cry基因的分类研究
• 1.4 cry基因的定位研究
• 1.5 cry基因的表达调控机制
• 2.苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白作用机理
• 2.1 Bt杀虫晶体蛋白的结构
• 2.2 杀虫晶体蛋白作用模式
• 3.苏云金芽孢杆菌的研究现状
• 3.1 高毒力菌株的分离及新型杀虫基因的克隆
• 3.2 Bt工程菌株的构建
• 3.3 杀虫作用机制研究
• 3.4 昆虫抗性机理研究和抗性管理
• 4.虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ
• 5.立题依据和意义
• 材料与方法
• 1.材料
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 培养基和抗生素
• 1.3 试剂和寡核苷酸
• 1.4 仪器设备
• 2.方法
• 2.1 hwtx-Ⅰ基因分子设计
• 2.2 中间载体pUAK的构建
• 2.3 pUKH1质粒的构建
• 2.4 pUKH2质粒的构建
• 2.5 pUKH4质粒的构建
• 2.6 表达质粒pXH4的构建
• 2.7 hwtx-Ⅰ基因四价体在苏云金杆菌中的表达
• 2.8 重组蛋白N-端氨基酸序列分析
• 2.9 原子力显微镜观察
• 2.10 工程菌株杀虫毒力生测
• 结果与分析
• 1.hwtx-Ⅰ分子设计
• 2.表达载体pXH4的构建
• 2.1 质粒pUAK的构建
• 2.2 表达载体pXH4的构建
• 3.hwtx-Ⅰ四价体的克隆与表达
• 4.目的蛋白N-端测序结果
• 5.Hwtx-Ⅰ四价体蛋白三维结构预测
• 6.原子力显微镜观察
• 7.工程菌株毒力生测
• 讨论
• 1.多价体基因衔接子Iinker的分子设计
• 2.hwtx-Ⅰ基因的分子设计
• 3.hwtx-Ⅰ基因四价体的表达策略
• 4.工程菌株的杀虫机理探讨
• 5.本项研究的创新与特色
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 湖南师范大学学位论文原创性声明