血红素氧合酶-1在骨肉瘤多药耐药形成过程中的作用及机制研究

论文摘要

目的:建立人骨肉瘤多药耐药细胞系143B/ADM,并分析其生物学特性。方法:本实验采用逐步递增阿霉素（ADM）浓度间歇作用的方法诱导建立143B/ADM耐药细胞株。采用WST-8法检测不同抗肿瘤药物对人骨肉瘤野生型和耐药型细胞的增殖作用影响,计算半数抑制率（IC50）及耐药指数（RI）,并通过冻存复苏、撤药实验观察耐药细胞株稳定性;比较野生型与耐药细胞株在细胞贴壁率、生长曲线、群体倍增时间等方面的差异,双层软琼脂实验观察143B/WT及143B/ADM细胞克隆形成率;台盼蓝拒染实验及结晶紫染色定量分析细胞活力;流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡和罗丹明外排;Realtime PCR及免疫印迹法检测耐药相关蛋白（MDR-1、MRP-1和LRP）的表达。结果:人骨肉瘤143B/ADM耐药细胞株对ADM的耐药指数为15.7,并且143B/ADM对其它抗癌药物均产生了不同程度的耐药,冻存/复苏及撤药对143B/ADM的耐药指数无明显影响。相对于143B/WT细胞株,143B/ADM生长缓慢,细胞群体倍增时间延长,细胞克隆形成率明显增加,细胞周期中G1和S期所占比例增加,而G2/M期所占比例明显减少,细胞存活率增加。Realtime PCR和免疫印迹发现,143B/ADM耐药细胞株MDR-1表达明显增强,而MRP-1和LRP表达无明显变化。细胞内罗丹明外排实验显示,143B/ADM细胞内罗丹明明显减少。用10μg/ml的ADM分别处理143B/WT和143B/ADM细胞72 h后,流式细胞和激光共聚焦显微镜分析表明143B/ADM耐药细胞的凋亡率明显少于143B/WT细胞。结论:我们已成功建立人骨肉瘤多药耐药细胞株143B/ADM。其耐药机制可能与MDR-1表达增加,导致抗癌药物外排增多,减少药物对骨肉瘤细胞的细胞毒作用有关。目的:研究血红素氧合酶-1（Heme oxygenase-1,HO-1）、蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）在人骨肉瘤细胞多药耐药中的作用,分析HO-1、PKC、MDR-1三者之间的关系,揭示人骨肉瘤细胞多药耐药的潜在机制。方法:1、首先用Realtime PCR和/或Western-blot法检测143B/WT和143B/ADM细胞中HO-1、PKC和MDR-1的表达情况,用分光光度计法测定了HO-1活性,分析HO-1、PKC和MDR-1之间的相关性。2、分别通过转染HO-1质粒、HO-1 siRNA的方式干预143B细胞中HO-1的表达,Realtime PCR和/或Western-blot法检测HO-1、PKC和MDR-1的表达,流式细胞术分析细胞内罗丹明浓度以测定细胞外排药物能力, WST-8检测细胞增殖能力,以评价ADM的半数抑制率（IC50）和耐药指数（RI）。进而用10μg/ml ADM分别处理上述干预组的143B细胞株,分光光度计测定ADM处理1 h后细胞内ADM浓度,流式细胞仪检测ADM处理72 h后细胞凋亡率。3、用PKC特异性抑制剂星形孢菌素（Staurosporine,Stau）干预143B/ADM耐药细胞和转染了HO-1的143B/WT细胞72 h,Real-time PCR和/或Western-blot法检测HO-1、PKC和MDR-1的表达,分光光度计法测定细胞中HO-1活性,流式细胞术分析细胞内罗丹明浓度以测定细胞外排药物能力, WST-8检测细胞增殖能力,以评价ADM的IC50和RI。进而用10μg/ml ADM分别处理上述干预组细胞,分光光度计测定ADM处理1 h后细胞内ADM浓度,流式细胞仪检测ADM处理72 h后细胞凋亡率。结果:1.与143B/WT细胞相比,143B/ADM耐药细胞HO-1表达增加,活性增强。PKC蛋白表达增加,同时MDR-1表达增加,细胞内ADM浓度明显降低,ADM处理细胞后凋亡明显减少。2.与转染空白对照质粒的143B/WT细胞相比,转染HO-1质粒的143B/WT细胞,HO-1、PKC和MDR-1表达显著增加,HO-1活性增强,ADM的IC50和RI值明显增加,细胞内罗丹明和ADM浓度显著降低,ADM作用72h后细胞凋亡明显减少。而与143B/ADM耐药细胞相比,转染HO-1 siRNA的143B/ADM细胞HO-1、PKC和MDR-1表达显著下调,HO-1活性降低,ADM的IC50和RI值明显减小,细胞内罗丹明和ADM浓度显著增加,ADM作用72h后细胞凋亡明显增多。3.给予转染了HO-1质粒的143B/WT细胞PKC特异性抑制剂Stau处理后, HO-1表达及其活性未见明显变化,但MDR-1蛋白表达明显降低,细胞内罗丹明浓度增高,同时ADM的IC50和RI值明显降低;10μg/ml ADM处理细胞后,细胞内ADM浓度增高, 72 h后凋亡明显增加。给予143B/ADM耐药细胞相同处理后,也见如此效应。结论:1. HO-1的过表达及激活可介导MDR-1的表达,促进细胞外排ADM,减少抗肿瘤药物对人骨肉瘤细胞的毒性。2.过表达的PKC可上调MDR-1的表达,促进细胞外排ADM,减少抗肿瘤药物对人骨肉瘤细胞的毒性。3.人骨肉瘤143B/ADM细胞可通过过表达HO-1的方式,激活PKC的表达,并进一步上调MDR-1,促进细胞外排抗癌药物,减少骨肉瘤细胞内抗癌药物浓度,从而减少药物对细胞的毒性作用,产生多药耐药。目的:研究干预人骨肉瘤细胞HO-1表达对人骨肉瘤裸鼠模型骨肉瘤耐药的影响,并进一步探讨其机制,为人骨肉瘤耐药的逆转寻找新靶点。方法:将人骨肉瘤细胞株143B移植到裸鼠皮下,制备人骨肉瘤裸鼠模型。实验分为四组:143B/WT野生型组、143B/WT +HO-1过表达组、143B/ADM耐药组、143B/ADM +HO-1 siRNA组。将以上不同类型的143B细胞接种裸鼠成瘤后,给予阿霉素（ADM）干预,观察不同分组小鼠体重等一般情况、肿瘤体积、重量、病理学改变等指标,检测肿瘤组织中凋亡关键酶caspase-3和-8活性,Realtime PCR和/或免疫印迹法检测肿瘤组织中HO-1、PKC和MDR-1的表达,分光光度计法检测肿瘤组织中HO-1活性。结果:1.与143B/WT组相比,143B/WT +HO-1过表达组和143B/ADM组动物接受ADM干预后,肿瘤缩小及病理学改变不如143B/WT组明显,caspase-3和-8活性低,且肿瘤组织中HO-1、PKC和MDR-1的表达以及HO-1活性明显高于143B/WT组。2.与143B/ADM组相比,143B/ADM +HO-1 siRNA组动物接受ADM干预后,肿瘤缩小及病理学改变显著,caspase-3和-8活性增加,肿瘤组织中HO-1、PKC和MDR-1的表达以及HO-1活性降低。结论:HO-1在人骨肉瘤裸鼠模型耐药中起着关键作用,针对HO-1开展的治疗和干预将很有可能为骨肉瘤耐药的逆转和治疗提供新的思路和方法。

论文目录

• 符号说明
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 人骨肉瘤多药耐药细胞系的建立及其生物学特性
• 前言
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 第二部分 血红素氧合酶-1 在人骨肉瘤细胞多药耐药 中的作用及分子机制研究
• 前言
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 第三部分 血红素氧合酶-1 在人骨肉瘤动物模型肿瘤耐药中的作用研究
• 前言
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 全文小结
• 攻读博士学位期间发表的论文
• 致谢