薯蓣植物内生放线菌及其组织培养相关性研究

论文摘要

淮山和大薯是我国南方栽培面积较广,食用、药用价值较高的两种薯蓣植物。近年来,由于大面积的人工栽培,带来了严重的病害问题。植物内生放线菌因具有增强宿主植物抗病性、抗旱性以及促生长和竞争的能力,已逐渐被用做植物的生物保护剂。本研究以采集海南大学农学院薯蓣植物资源圃的淮山和大薯为对象,探讨薯蓣植物内生放线菌的多样性,通过活性评价从中发掘具有应用潜力的菌种资源；开展了大薯组织培养的初步研究,并探讨了内生放线菌与大薯组培苗之间的关系。本研究首次对薯蓣植物淮山与大薯的内生放线菌进行分离,从淮山与大薯植物样品中共分离到117株内生放线菌。依据形态和培养特征的差异,将全部菌株分属于35个单株种群和17个多株种群,共52个种群。选取19株代表性内生放线菌做了16S rRNA基因序列分析,结果显示19株菌株全都为链霉菌属的放线菌,在19株代表性菌株中,有9株菌的16S rRNA基因序列相似性与最近的典型链霉菌相比低于90%,并在链霉菌系统发育树上单独形成分支,预示这9株菌可能是潜在的新分类单元。对这些内生放线菌的淀粉酶活性、产生长素的能力及抗炭疽病的活性进行了检测。结果显示从中获得90株产淀粉酶的菌株,其中60株具有较强的酶活性；检测到38株菌株的发酵液里有吲哚乙酸,其中菌株DOR3-5的吲哚乙酸产量达到52.32μg/mL;筛选到23株具有较强抗炭疽病活性的内生放线菌,其中菌株DOR3-2的抑菌活性最强,具有广谱的抗菌活性。结合形态、生理生化特征及16SrRNA基因序列分析,将菌株DOR3-2鉴定为一株新的利迪链霉菌。综合上述结果获得一批具有进一步开发研究价值的菌株资源。对大薯的组织培养做了初步的探索。加入1g/L PVP、并适时地转接能有效地抑制外植体的褐化；带芽茎段在MS基本培养基上不添加任何激素,均能达到较高的萌芽率,添加0.2 mg/L 6-BA+1mg/L NAA有利于组培苗的生长、发育；而添加1 mg/L6-BA+0.1mg/L NAA,则有利于愈伤组织的诱导；茉莉酸在低浓度下,促进茎结的生长,高浓度下对组培苗的生长发育表现出抑制作用；3%蔗糖浓度利于组培苗根茎叶的数量增殖。5%的蔗糖浓度利于大薯根及微型薯块的形成,但对根茎叶的生长有抑制。大多数实验菌株的发酵液对组培苗生长有一定的影响,部分菌株促进大薯叶、茎节、根及微型薯块的增殖,部分菌株对叶、茎节、根及微型薯块的生长有抑制。同一菌株对大薯组培苗各器官的生长也存在差异。菌株DOR3-2回接大薯组培苗,在各个器官中定殖成功,并增强了组培苗抗炭疽病的能力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 植物内生放线菌的研究概况
• 1.1.1 植物内生放线菌的分布与多样性
• 1.1.2 植物内生放线菌代谢产物的多样性
• 1.1.2.1 抗生素类物质
• 1.1.2.2 植物生长调节类物质
• 1.1.2.3 新特性酶类物质
• 1.1.3 植物内生放线菌在生物防治上的应用
• 1.2 薯蓣植物的研究概况
• 1.2.1 薯蓣植物组织培养
• 1.3 本论文研究的背景、目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验主要试剂
• 2.1.3 实验主要仪器
• 2.1.4 实验的主要培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 薯蓣植物内生放线菌的分离
• 2.2.2 放线菌的纯化、形态特征观察及分类归群
• 2.2.3 放线菌生物活性测定
• 2.2.4 代表性放线菌DNA的提取、16S rRNA基因PCR扩增
• 2.2.5 活性菌株DOR3-2的分类鉴定
• 2.2.6 大薯的组织培养
• 2.2.7 内生放线菌发酵液促大薯组培苗生长
• 2.2.8 放线菌DOR3-2回接大薯组培苗
• 2.2.9 放线菌DOR3-2接种大薯组培苗及其抗炭疽病特性
• 2.2.10 大薯组培苗炼苗及移栽
• 3 结果与分析
• 3.1 内生放线菌的分离
• 3.2 内生放线菌的培养特征及分群
• 3.3 内生放线菌的生物活性评价
• 3.3.1 内生放线菌产淀粉酶活性筛选
• 3.3.2 内生放线菌产生长素吲哚乙酸（IAA）的筛选
• 3.3.3 内生放线菌抗炭疽病原菌活性筛选
• 3.4 代表性内生放线菌的16S rRNA基因序列系统发育分析
• 3.4.1 内生放线菌的DNA的提取及16S rRNA基因序列测定
• 3.4.2 薯蓣植物内生放线菌的16S rRNA基因序列系统发育树构建
• 3.5 大薯组织培养
• 3.5.1 外植体最佳消毒时间及最佳防褐化剂的确定
• 3.5.2 不同激素配比对大薯组培苗的影响
• 3.5.3 不同茉莉酸浓度对大薯组培苗生长的影响
• 3.5.4 蔗糖浓度对大薯组培苗的增殖及微型薯形成的影响
• 3.5.5 内生放线菌对大薯组培苗的增殖及微型薯形成的影响
• 3.5.6 内生放线菌DOR3-2回接大薯组培苗及抗炭疽病活性
• 3.5.6.1 内生放线菌DOR3-2抗菌谱
• 3.5.6.2 内生放线菌DOR3-2回接大薯的组培苗
• 3.5.6.3 内生放线菌DOR3-2回接大薯的组培苗对炭疽病抗性
• 3.5.7 大薯组培苗炼苗及移栽
• 3.6 内生放线菌DOR3-2分类鉴定
• 3.6.1 内生放线菌DOR3-2 16S rRNA基因序列系统发育分析
• 3.6.2 内生放线菌DOR3-2形态及培养特征
• 3.6.3 内生放线菌DOR3-2生理生化特征
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 论文发表