微生物法制备还原型谷胱甘肽的工艺研究

论文摘要

还原型谷胱甘肽（reduced glutathione, GSH）是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸缩合而成的一种含有巯基的生物活性三肽化合物,是人体细胞内的主要代谢物质,具有清除自由基、解毒、促进肝酶活性等生理功能。在食品工业中,GSH亦可起到增强肉类风味、预防色素沉着及防止水果褐变等作用。日本等一些发达国家很早就开始研究GSH且基本垄断了中国市场,我国主要是以微生物发酵法生产GSH,亟需对其工艺进行优化改进以提高GSH的产率。本文从中科院沈阳应用生态研究所菌种保藏室的酵母菌库中筛选得到一株产GSH能力较高的酿酒酵母Y,其GSH产量达9.60 mg/g。改进发酵培养基配方以促进菌体生长和提高GSH产量,采用添加L-半胱氨酸和补加葡萄糖的策略,使得菌体浓度提高12.4倍,胞内GSH产量达12.94 mg/g干菌体。选用热水抽提法和乙醇提取法提取胞内GSH,通过单因素实验和正交实验对pH值（A）、提取温度（B）、提取时间(0、料液比（D）4个因素进行优化,并对两种方法的提取效率和提取条件进行比较,确定最佳提取方法为热水抽提法,提取条件：料水比1：3,提取液pH 2.0,90℃水浴中提取10min, GSH的提取量可达14.27 mg/g。为了提高GSH纯度,采用离子交换和葡聚糖凝胶层析技术分离纯化提取液中的GSH。通过静态实验优化分离条件：D0017阳离子交换树脂,提取液上柱pH 4.5,用pH 7.0磷酸氢二钠-柠檬酸盐缓冲液+03 mol/L NaCl进行洗脱,将最优条件应用于上柱分离实验中,柱高15 cm,洗脱流速2.0 mL/min, GS H回收率为91.46%。将GSH浓度大于250μmol/L的部分进行冷冻干燥,浓缩后上Sephadex G-10凝胶层析柱,再次纯化,最佳纯化条件为：柱高45 cm,上柱量为柱体积10%,去离子水洗脱,流速为10 mL/min,GSH回收率为86.18%,杂蛋白去除率为87.6%。由实验结果可知,热水抽提法提取GSH耗时短、无污染、提取彻底,用离子交换法和葡聚糖凝胶层析分离纯化GSH效果好、操作简便、能较好的去除杂蛋白,有利于工业化生产。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 谷胱甘肽概述
• 1.1.1 谷胱甘肽结构及性质
• 1.1.2 谷胱甘肽在自然界的分布
• 1.1.3 谷胱甘肽的生理功能
• 1.1.4 谷胱甘肽的应用
• 1.2 谷胱甘肽的生产
• 1.2.1 溶剂萃取法
• 1.2.2 化学合成法
• 1.2.3 酶法
• 1.2.4 发酵法
• 1.2.4.1 高产菌株优选
• 1.2.4.2 发酵工艺条件研究
• 1.3 谷胱甘肽的提取及分离纯化
• 1.3.1 谷胱甘肽提取方法的研究
• 1.3.2 谷胱甘肽分离纯化方法的研究
• 1.3.2.1 铜盐法
• 1.3.2.2 离子交换树脂法
• 1.3.2.3 双水相法
• 1.4 谷胱甘肽的测定方法
• 1.4.1 酶循环法
• 1.4.2 亚硝基铁氰化钠法
• 1.4.3 四氧嘧啶法
• 1.4.4 高效液相色谱法
• 1.5 本研究的意义及主要内容
• 1.5.1 研究的意义
• 1.5.2 研究的主要内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 主要试剂的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌种的选育及保藏
• 2.2.1.1 培养基
• 2.2.1.2 培养方式
• 2.2.2 分析测定方法
• 2.2.2.1 细胞干重的测定
• 2.2.2.2 蛋白质含量的测定
• 2.2.2.3 葡萄糖含量的测定
• 2.2.2.4 GSH含量的测定—四氧嘧啶法
• 2.2.2.5 GSH回收率的计算
• 2.2.2.6 蛋白去除率的计算
• 2.2.2.7 树脂吸附率的计算
• 2.2.3 高产菌株的筛选
• 2.2.4 培养基的优化实验
• 2.2.5 热水抽提法提取GSH的优化实验
• 2.2.5.1 料水比对提取效率的影响
• 2.2.5.2 pH值对提取效率的影响
• 2.2.5.3 温度对提取效率的影响
• 2.2.5.4 提取时间对提取效率的影响
• 2.2.5.5 热水抽提法的正交实验优化设计
• 2.2.6 乙醇抽提法提取GSH的优化实验
• 2.2.6.1 料液比对提取效率的影响
• 2.2.6.2 乙醇浓度对提取效率的影响
• 2.2.6.3 提取时间对提取效率的影响
• 2.2.6.4 乙醇抽提法的正交实验优化设计
• 2.2.7 GSH的分离纯化
• 2.2.7.1 大孔树脂D0017的预处理及再生
• 2.2.7.2 GSH分离静态吸附实验—上样液pH值
• 2.2.7.3 GSH分离静态解吸实验—洗脱液种类及其pH值
• 2.2.7.4 GSH分离静态解吸实验—洗脱液中添加不同浓度的NaCl
• 2.2.7.5 GSH动态分离实验
• 2.2.7.6 Sephadex G-10的预处理及再生
• 2.2.7.7 Sephadex G-10分离纯化
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 产GSH菌株的选育
• 3.1.1 菌种初筛
• 3.1.2 酿酒酵母培养基的优化
• 3.1.2.1 氨基酸对酿酒酵母产GSH的影响
• 3.1.2.2 L-半胱氨酸的添加时间及模式对产GSH的影响
• 3.1.2.3 补加葡萄糖对酿酒酵母产GSH的影响
• 3.2 提取GSH的两种方法
• 3.2.1 热水抽提法单因素条件
• 3.2.1.1 料水比对提取效果的影响
• 3.2.1.2 pH值对提取效果的影响
• 3.2.1.3 温度对提取效果的影响
• 3.2.1.4 提取时间对提取效果的影响
• 3.2.2 热水抽提条件的正交优化
• 3.2.3 乙醇提取法单因素条件
• 3.2.3.1 料液比对提取效果的影响
• 3.2.3.2 乙醇浓度对提取效果的影响
• 3.2.3.3 提取时间对提取效果的影响
• 3.2.4 乙醇提取条件的正交优化
• 3.2.5 两种提取GSH方法的比较
• 3.3 GSH的分离纯化
• 3.3.1 静态吸附解吸实验
• 3.3.1.1 前期提取GSH实验结果
• 3.3.1.2 上样液最佳pH值
• 3.3.1.3 洗脱液种类及其pH值
• 3.3.1.4 洗脱液中添加NaCl对分离效果的影响
• 3.3.2 动态分离GSH实验
• 3.3.3 GSH纯化实验
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录