论文摘要
芥子油苷及其代谢产物具有抗癌功效,是蔬菜中一类重要的功能成分,其中萝卜硫苷的代谢产物萝卜硫素是目前已知的抗癌活性最强的天然植物化学物质青花菜芽菜是青花菜种子发芽后7-9d的嫩芽,因富含萝卜硫苷和萝卜硫素而成为芥子油苷代谢研究的模式体系。芥子油苷的生物合成途径在模式植物拟南芥中已经基本阐明。芥子油苷的合成与积累不仅与其所处的发育阶段有关,而且受到其内部信号分子和外界环境包括生物因素和非生物因素的调控。本文致力于探索改善青花菜芽菜中芥子油苷等品质成分的安全有效的化学调控手段。通过分析各种化学调控方式如激素,糖和氯化钠等对青花菜芽菜中芥子油苷等功能成分和品质的影响,找出促进青花菜芽菜中功能成分芥子油苷积累的化学调控手段,并探索这些化学调控方式促进芥子油苷积累的分子机制。在此基础上,以模式植物拟南芥的各种激素,糖和芥子油苷相关的突变体以及转基因植物为材料,探究不同的化学手段调控芥子油苷代谢的分子机理,以完善芥子油苷的代谢调控网络,并为更好地应用化学调控方式改善蔬菜保健品质提供理论依据和技术支撑。得到如下结果：1、蔗糖可以有效促进青花菜芽菜中芥子油苷和花青素的积累,但对这两种物质的诱导机制存在差异。研究了不同种类的糖（蔗糖,葡萄糖,山梨醇和果糖）对青花菜芽菜中主要功能成分芥子油苷和花青素的影响,结果表明,蔗糖,葡萄糖.山梨醇和果糖处理都可以促进青花菜芽菜中芥子油苷和花青素的积累,其中,蔗糖在促进芥子油苷和花青素积累方面最为有效,但是蔗糖对二者的调控机制不尽相同,蔗糖促进花青素积累的作用并不能够被1：1葡萄糖果糖复合物所模拟,故蔗糖可能是以蔗糖分子的形式调控花青素的合成和积累。通过分析蔗糖处理青花菜芽菜后花青素合成相关基因的表达发现,蔗糖可以在分子水平上调控其转录因子（BoMYB2, BoMYB3和BoTT8）和合成基因（CHS, CHI, F3H, F3’H, DFR, LDOX和GST）进而调控花青素的合成。蔗糖也可以促进芥子油苷合成基因BoElong的表达,同时1：1葡萄糖果糖复合物对芥子油苷合成的促进作用与蔗糖很相似,因此蔗糖更可能是通过转化为单分子的葡萄糖或者果糖来调控芥子油苷的合成。黑芥子酶是芥子油苷的水解酶,其活性强弱在芥子油苷代谢过程中起着重要作用。葡萄糖以及1：1葡萄糖果糖复合物都显著降低了芽菜中黑芥子酶的活性,而蔗糖,果糖和甘露醇处理都对其活性影响不大。因此,蔗糖作为一种外源处理可以促进青花菜芽菜中芥子油苷的合成,并且不影响其降解酶的活性,可以更好地改善青花菜芽菜的品质。2、JA对芥子油苷的调控需要调节子MED和转录因子MYB的参与,JA和葡萄糖协同促进芥子油苷的生物合成。通过分析茉莉酸（jasmonic acid,JA）处理拟南芥野生型及其突变体后其地上部和地下部中芥子油苷的含量变化,发现JA可以显著促进拟南芥野生型地上部和地下部中脂肪类和吲哚类芥子油苷的积累,而在芥子油苷突变体myb29, myb34和myb122中,JA对芥子油苷积累的促进作用则被大大减弱。同时,MED的突变也使得JA对脂肪类芥子油苷和吲哚类芥子油苷的促进作用明显减弱,且JA处理med25后,其MYB34, MYB76和MYB122的表达都没有发生显著变化,而在野生型中,JA处理3h后MYB34, MYB76和MYB122的表达水平就达到最高。因此,调节子MED有可能通过MYB转录因子来参与JA对芥子油苷的调控。此外,不同浓度JA（5μM,10μM,20μM和50μM）和250mM葡萄糖共同处理均可以更显著地促进脂肪类和吲哚类芥子油苷的积累。JA和葡萄糖共同处理使得芥子油苷合成相关的转录因子MYB28, MYB29和MYB122及其合成基因CYP79B2, CYP79B3, CYP83B1, CYP79F1, CYP79F2, CYP83A1, UGT74B1和UGT74C1的表达量显著增加。与野生型相比JA和葡萄糖共同处理对JA信号转导突变体coil, jar1和jin1中脂肪类和吲哚类芥子油苷积累的促进作用都显著减弱。同样地,JA和葡萄糖共同处理对葡萄糖信号转导突变体rgs1-2和abi5-7中芥子油苷合成的诱导作用也减弱。这些结果表明JA和葡萄糖信号在调控芥子油苷生物合成中存在互作关系,JA信号以及葡萄糖信号的膜受体和信号转导组分ABI5在JA和葡萄糖协同调控芥子油苷合成过程中起着重要作用。3、氯化钠单独处理或者与EBR结合处理都可以促进青花菜芽菜中芥子油苷的积累。分别以0mM,20mM,40mM,60mM,80mM和100mM氯化钠处理青花菜芽菜,发现低浓度（20mM和40mM）的氯化钠可以促进芽菜的生长；较高浓度如60mM氯化钠处理5d可以使其生物量和总芥子油苷含量显著提高；高浓度如100mM氯化钠处理3d可以显著提高青花菜芽菜中的芥子油苷和萝卜硫素的含量。而且表油菜素内酯（24-epibrassinolide,EBR）和氯化钠结合处理也可以促进青花菜芽菜中芥子油苷的积累。其中0.001mg/L EBR和40mM氯化钠处理将芽菜中总芥子油苷的含量提高了86%,其中4-甲基亚磺酰丁基芥子油苷的含量提高了85%。0.01mg/L EBR单独处理降低了青花菜芽菜中抗坏血酸的含量,但当处在40mM氯化钠条件下时,0.01mg/L EBR不仅提高了芽菜的生物量而且其抗坏血酸也比单独氯化钠处理提高了59%。故而,EBR单独处理或者与氯化钠结合处理都可以作为一种提高芽菜营养的化学调节手段应用于芽菜的生产中。4、BR通过信号转导组分BZR1和BES1抑制芥子油苷的合成。以BR合成和信号转导相关突变体和转基因植株以及芥子油苷合成相关突变体为材料,研究了BR对拟南芥中芥子油苷合成的影响,发现BR在正常条件下显著降低了拟南芥中主要的芥子油苷组分,如3-甲基亚磺酰丙基芥子油苷,4-甲基亚磺酰丁基芥子油苷和4-甲硫丁基芥子油苷以及吲哚基-3-甲基芥子油苷和1-甲氧吲哚基-3-甲基芥子油苷等的积累。BR合成缺失突变体cpd中芥子油苷含量的升高和内源BR含量增加的转基因植株DWF4-ox中芥子油苷含量的下降进一步证明了BR对芥子油苷合成的抑制作用。通过分析bri1-5,35S-BZR1/bzr1-1D和bes1-D中芥子油苷含量和相关基因表达的变化情况,发现BR通过BRI1介导的BR信号转导途径对芥子油苷进行调控,其下游的BZR1和BES1则通过转录水平上抑制芥子油苷合成基因发挥作用。进一步分析芥子油苷合成相关突变体myb28,myb29, myb34,myb51,和myb122中芥子油苷含量在BR处理后的变化情况,结合BZR1靶基因的芯片数据,发现芥子油苷合成相关转录因子MYB28,MYB34和MYB122及其合成基因CYP79B2在BZR1负向调控芥子油苷合成和积累过程中起着关键作用。
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致谢摘要Abstract英文缩略词1 绪论1.1 芥子油苷的发现和分布1.2 芥子油苷的合成和降解1.3 芥子油苷的生物学功能1.3.1 芥子油苷的抗癌作用1.3.2 芥子油苷在植物防卫反应中的作用1.4 外界环境对芥子油苷的影响1.4.1 非生物因素对芥子油苷的影响1.4.2 生物因素对芥子油苷的影响1.5 信号分子对芥子油苷合成的调控1.5.1 茉莉酸和水杨酸对芥子油苷的调控1.5.2 油菜素甾醇类化合物对芥子油苷的调控1.5.3 糖信号对芥子油苷的调控1.6 青花菜芽菜中芥子油苷的调控1.7 立题依据及研究目标2 不同糖处理对青花菜芽菜中芥子油苷的影响及其机理2.1 引言2.2 材料与方法2.2.1 实验材料及试剂2.2.2 材料种植及处理方法2.2.3 实验方法2.2.3.1 芥子油苷的分离纯化与分析测定2.2.3.2 花青素的提取与检测2.2.3.3 黑芥子酶活性测定2.2.3.4 FRAP法测定抗氧化能力2.2.3.5 可溶性蛋白含量的测定2.2.3.6 RNA提取2.2.3.7 实时定量PCR检测2.2.3.8 数据分析2.3 结果与分析2.3.1 不同糖处理对青花菜芽菜发芽率和生物量的影响2.3.2 不同糖处理对青花菜芽菜中芥子油苷含量的影响2.3.3 不同糖处理对青花菜芽菜中花青素含量的影响2.3.4 不同糖处理对青花菜芽菜抗氧化能力的影响2.3.5 蔗糖对青花菜芽菜中花青素合成相关基因的影响2.3.6 蔗糖对青花菜芽菜中芥子油苷合成基因表达的影响2.3.7 不同糖处理对青花菜芽菜中黑芥子酶活性的影响2.3.8 不同糖处理对拟南芥中芥子油苷含量的影响2.4 讨论与小结3 JA对拟南芥中芥子油苷合成的影响3.1 引言3.2 材料与方法3.2.1 实验材料及试剂3.2.2 材料种植及处理方法3.2.3 实验方法3.2.3.1 芥子油苷的分离纯化3.2.3.2 芥子油苷的分析测定3.2.3.3 RNA的提取3.2.3.4 实时定量PCR检测3.2.3.5 数据分析3.3 结果与分析3.3.1 JA对拟南芥野生型及其突变体中芬子油苷的影响3.3.1.1 JA对拟南芥地上部野生型及其突变体中脂肪类芥子油苷的影响3.3.1.2 JA对拟南芥地上部野生型及其突变体中吲哚类芥子油苷的影响3.3.1.3 JA对拟南芥地下部野生型及其突变体中脂肪类芥子油苷的影响3.3.1.4 JA对拟南芥地下部野生型及其突变体中吲哚类芥子油苷的影响3.3.2 MED参与JA对芥子油苷合成的调控3.3.2.1 MED缺失突变体med2.5中芥子油苷的含量分析及其对JA的响应3.3.2.2 JA处理后med2.5中芥子油苷合成相关转录因子的表达情况3.4 讨论与小结4 JA和糖对拟南芥中芥子油苷合成的影响4.1 引言4.2 材料与方法4.2.1 实验材料及试剂4.2.2 材料种植及处理方法4.2.3 实验方法4.2.3.1 芥子油苷的分离纯化4.2.3.2 芥子油苷的分析测定4.2.3.3 RNA提取4.2.3.4 实时定量PCR检测4.2.3.5 数据分析4.34.3.2 JA和葡萄糖共同处理对拟南芬中芬子油苷合成相关基因表达的影响4.3.3 葡萄糖处理对JA信号转导突变体中芥子油苷含量的影响4.3.3.1 葡萄糖处理对JA信号转导突变体coi1-2中芥子油苷含量的影响4.3.3.2 葡萄糖处理对JA信号转导突变体jin1,jar1中芥子油苷含量的影响4.3.4 JA处理对葡萄糖信号转导突变体中芥子油苷含量的影响4.3.4.1 JA处理对葡萄糖受体突变体rgs1-2中芥子油苷含量的影响4.3.4.2 JA和葡萄糖共同处理对糖不敏感突变体abi5-7中芥子油苷含量的影响4.3.5 SA在JA与葡萄糖协同调控芥子油苷合成与积累过程中的作用4.3.5.1 低浓度SA在JA和葡萄糖协同调控芥子油苷积累过程中的作用4.3.5.2 高浓度SA在JA和葡萄糖协同调控芥子油苷积累过程中的作用4.4 讨论与小结5 氯化钠对青花菜芽菜中芥子油苷的影响5.1 引言5.2 材料与方法5.2.1 实验材料及试剂5.2.2 材料种植及处理方法5.2.3 实验方法5.2.3.1 芥子油苷的分离纯化与分析测定5.2.3.2 萝卜硫素含量的测定5.2.3.3 黑芥子酶活性测定5.2.3.4 数据分析5.3 结果与分析5.3.1 氯化钠处理对青花菜芽菜发芽率和生物量的影响5.3.2 氯化钠处理对青花菜芽菜芥子油苷含量的影响5.3.3 氯化钠处理对青花菜芽菜中黑芥子酶活性的影响5.3.4 氯化钠处理对青花菜芽菜中萝卜硫素含量的影响5.4 讨论与小结6 BR和氯化钠处理对青花菜芽菜中芥子油苷的影响6.1 引言6.2 材料与方法6.2.1 实验材料及试剂6.2.2 材料种植及处理方法6.2.3 实验方法6.2.3.1 芥子油苷的分离纯化与分析测定6.2.3.2 维生素C的提取及分析6.2.3.3 黑芥子酶活性测定6.2.3.4 FRAP法测定抗氧化能力6.2.3.5 数据分析6.3 结果与分析6.3.1 BR和氯化钠处理对青花菜芽菜发芽率和生物量的影响6.3.2 BR和氯化钠处理对青花菜芽菜芥子油苷含量的影响6.3.3 BR和氯化钠处理对青花菜芽菜中维生素C含量的影响6.3.4 BR和氯化钠处理对青花菜芽菜中黑芥子酶活性的影响6.3.5 BR和氯化钠处理对青花菜芽菜中抗氧化能力的影响6.4 讨论与小结7 BR对拟南芥中芥子油苷合成的影响7.1 引言7.2 材料与方法7.2.1 实验材料及试剂7.2.2 材料种植及处理方法7.2.3 实验方法7.2.3.1 芥子油苷的分离纯化7.2.3.2 芥子油苷的分析测定7.2.3.3 RNA提取7.2.3.4 实时定量PCR检测7.2.3.5 过表达植株的构建7.2.3.6 浸花法转化拟南芥7.2.3.7 转基因种子的筛选与鉴定7.2.3.8 数据分析7.3 结果与分析7.3.1 BR对拟南芥野生型Col-0中芥子油苷合成的影响7.3.2 BR合成缺失突变体cpd和过量表达植株DWF4-ox中芥子油苷含量的变化7.3.3 BR受体突变体bri1-5中芥子油苷含量的变化7.3.4 BR信号转导增强植株35S-BZR1/bzr1-1D和besl-D中芥子油苷含量的变化7.3.5 BR信号转导增强植株35S-BZR1/bzr1-1D和besl-D中芥子油苷合成基因的表达7.3.6 BR处理对芥子油苷突变体myb28,myb29,myb34,myb51和myb122的影响7.3.7 DET2在芥子油苷合成过程中的作用7.3.7.1 突变体det2-1中芥子油苷的组分7.3.7.2 突变体det2-1中芥子油苷的含量分析7.3.7.3 突变体det2-1背景型的确定7.3.7.4 det2-1中芥子油苷合成相关基因的表达7.3.7.5 外源EBR处理对det2-1中芥子油苷含量的分析7.3.7.6 35S-DET2转基因植株的构建及其芥子油苷含量分析7.4 讨论与小结8 结论,创新点与展望8.1 结论8.2 创新点8.3 展望参考文献个人简介
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化学调控对十字花科植物中芥子油苷代谢的影响及其机理
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