论文摘要
背景：骺板损伤占小儿全部长管状骨骨折的15%-30%，10%的骺板损伤将导致骨骼及关节畸形发育，不但给儿童心理带来严重影响，而且影响肢体功能，甚至丧失劳动能力[1]。组织工程技术的发展为治疗骺板损伤带来新的希望，大多数学者将重点放在组织工程骺板的构建上，并取得初步的成功。因为获得容易，人们最初将注意力放在软骨细胞上，但研究发现软骨细胞在体外扩增培养过程中会出现去分化和生物学功能衰退，并以合成和分泌软骨基质能力下降或消失为标志，因此具有生长潜力的软骨母细胞一骺板软骨细胞成为新的研究热点。目的：体外培养兔骺板软骨细胞，探索简便、高效的细胞培养方法。对培养细胞进行初步研究，观察细胞镜下形态、电镜下细胞超微结构，鉴定细胞是否分泌蛋白聚糖及其含量，鉴定细胞是否能合成II型胶原蛋白及是否表达相应mRNA。为骺板组织工程寻找良好的种子细胞，为下一步基因转染结合支架材料修复骺板损伤提供实验基础。方法：选取3周龄新西兰幼兔18只、雌雄不限、健康，体重约250-300g。分别切取三个部位的软骨(①股骨远端及胫骨近端的骺板软骨;②髂骨;③肋软骨，经改良三步酶消化获得细胞。将获得软骨细胞在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中原代、传代体外培养。分别取细胞悬液计算细胞产量和细胞成活率并用倒置显微镜及透射电镜观察培养细胞形态及超微结构，观察细胞生长状态。MTT四唑盐比色法检测不同代次骺板软骨细胞生长活性。Alcian blue染色确定培养细胞有蛋白聚糖生成及定量检测，免疫组织化学染色检测II型胶原蛋白产生， PCR证实细胞有II型胶原蛋白mRNA生成。结果：本实验方法体外培养幼兔骺板软骨细胞，收集过程简便、高效。培养过程中观察到股骨远端及胫骨近端的骺板软骨细胞在单位重量的细胞产量、生长速度和分化速度上优于髂骨、肋软骨细胞，但在生物学形态上，三个部位的细胞无明显差别。骺板软骨细胞贴壁生长及传代的生长全过程，多次传代后细胞增殖能力逐渐降低，细胞形态逐渐向“纤维化”细胞转变。前3代细胞具有较高的生物学及功能学特性表达。从第4代以后细胞形态改变逐渐丧失骺板软骨细胞特有结构，软骨细胞所特有的II型胶原及蛋白多糖渐消失，出现去分化现象。PCR检测有II型胶原mRNA的表达、Alcian blue染色显示第3代细胞蛋白聚糖含量高，MTT显示第2、3、4代细胞生长曲线呈倒“S”型，第2、3代细胞活性明显优于第4代，培养细胞均于第10天出现生长抑制。结论：1.兔骺板软骨细胞通过改良三步酶消化法获取方便，消化较彻底，存活率高，可获取大量骺板软骨细胞。2.体外培养的幼兔骺板软骨细胞前3代表型稳定，生物学及功能学特性表达良好，体外培养第2代、第3代细胞更适合作为骺板组织工程种子细胞来源。3.成功地建立了骺板软骨细胞的体外培养方法，并证实所培养出的细胞是骺板软骨细胞，为下一步基因转染结合支架材料修复骺板损伤提供实验基础。4.股骨远端及胫骨近端的骺板软骨细胞在单位重量的细胞产量、生长速度和分化速度上优于髂骨、肋软骨细胞，但在生物学形态上，三个部位的细胞无明显差别。